一种抗原自呈递工程化迁移体及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种抗原自呈递工程化迁移体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，ev)是由细胞分泌的纳米级脂质双层囊泡，用于细胞间通信。细胞外囊泡可包含来自起始细胞的跨膜蛋白、rna、dna和胞质内容物。基于细胞外囊泡的药物递送载体已被用于肿瘤等疾病的治疗。

2、产生ev的细胞类型的选择直接影响ev的特性和功能，因为衍生的ev将保留起始细胞的众多特性，包括膜刚性、表面分子，内容物等。使用不同的细胞类型获得ev会影响其抗肿瘤作用。目前ev的来源细胞类型包括肿瘤细胞、免疫细胞和间充质细胞等。

3、目前基于细胞外囊泡的肿瘤治疗可以分为两大类：天然细胞外囊泡和工程化细胞外囊泡。其中利用工程化细胞外囊泡治疗肿瘤的策略可分为以下几类：

4、一是ev作为药物递送载体进行肿瘤药物装载并直接杀伤肿瘤，加载的药物类型包括：1)化疗药，如紫杉醇、多柔比星，吉西他滨和顺铂；2)反义寡聚核苷酸(aso)；3)rna药物，如sirna,mirna；4)结合ev和合成纳米材料形成的融合囊泡(参见非专利文献：the role ofextracellular vesicles in cancer(kalluri,raghu,kathleen m,cell,2023apr 13；186(8):1610-26))。

5、二是ev作为药物递送载体加载免疫调节分子或抗原调节免疫细胞功能，从而间接杀伤肿瘤。比如，在ev中加入小分子sting激动剂可有效激活抗原呈递细胞和抗肿瘤免疫，以及加入rig-i激动剂可刺激免疫反应并抑制肿瘤生长。专利wo2011000551a1公开了将一种或多种癌症抗原加载到ev中，方法是将细胞与抗原共孵育或通过在ev分离后直接加载来完成。

6、基于工程化细胞外囊泡的肿瘤治疗技术在纳米医学领域越来越重要。工程化细胞外囊泡具有优于合成纳米制剂的许多优点：(1)高生物相容性；(2)低免疫原性，尤其是自体ev；(3)运输复杂分子的能力，保护它们免于降解；(4)潜在的主动靶向能力；(5)跨越生物屏障的能力。基于工程化细胞外囊泡的肿瘤治疗技术的缺点和难点在于：1)如何实现临床级，大规模的工程化细胞外囊泡的制造工艺；2)如何优化工程化细胞外囊泡半衰期；3)如何工程化改造细胞外囊泡实现肿瘤特异靶向性或免疫细胞特异靶向性。

7、对于延长半衰期：专利cn115843241a公开了具有改善半衰期的细胞外囊泡，其通过细胞外囊泡的表面修饰白蛋白结合结构域实现，具体为使白蛋白结合结构域与细胞外囊泡的表面蛋白形成融合蛋白。

8、对于靶向性：专利cn111544391a公开了一种用于治疗耐药肿瘤的靶向细胞外囊泡的制备方法，该制备方法主要将具有靶向cd44的透明质酸衍生物修饰于负载dox的evs表面。

技术实现思路

1、本发明提供了一种可以直接呈递肿瘤抗原多肽，激活并扩增免疫细胞从而介导肿瘤特异性杀伤的工程化迁移体。不同于以往的采用细胞外囊泡载药，本技术的抗原自呈递工程化迁移体来源于具有激活并扩增免疫细胞的完整信号的基因工程改造的来源细胞，其完全保留了来源细胞的特性，使其可以直接激活并扩增免疫细胞(如t细胞)，介导抗原特异的肿瘤杀伤。

2、本发明的第一方面，提供了一种抗原自呈递工程化迁移体。

3、所述的抗原自呈递工程化迁移体为细胞外囊泡。

4、所述的抗原自呈递工程化迁移体为纳米级脂质双层囊泡。

5、所述的抗原自呈递工程化迁移体的直径约500nm-10μm，优选800nm-10μm，进一步优选800nm-2μm；例如500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm等。

6、所述的抗原自呈递工程化迁移体表面具有标记分子，例如包含四个跨膜结构域的四跨膜蛋白超家族，可以包含33个成员，包括tspan1、tspan2、tspan3、tspan4、tspan5、tspan6、tspan7、tspan8、tspan9、tspan10、tspan11、tspan12、tspan13、tspan14、tspan15、tspan16、tspan17、tspan18、tspan19、tspan20(upk1b)、tspan21(upk1a)、tspan22(prph2)、tspan23(rom1)、tspan24(cd151)、tspan25(cd53)、tspan26(cd37)、tspan27(cd82)、tspan28(cd81)、tspan29(cd9)、tspan30(cd63)、tspan31、tspan32和tspan33。

7、所述的抗原自呈递工程化迁移体含有呈递抗原多肽的主要组织相容性复合物(mhc)或其变体。所述的mhc包括mhc i类分子和/或mhc ii类分子。优选的，所述的抗原自呈递工程化迁移体含有呈递抗原多肽的mhc i类分子和mhc ii类分子。其中，所述的呈递抗原多肽的mhc或其变体存在于抗原自呈递工程化迁移体的表面和/或内部。

8、所述的抗原包括内源或外源抗原。

9、所述的抗原自呈递工程化迁移体含有抗原多肽。

10、所述的抗原或抗原多肽存在于抗原自呈递工程化迁移体的内部和/或表面。

11、所述的抗原多肽可以为mhc i类分子呈递的抗原多肽或mhc ii类分子呈递的抗原多肽，也可以为mhc i类分子呈递的抗原多肽与mhc ii类分子呈递的抗原多肽连接的融合蛋白。

12、其中，所述的融合蛋白包括信号肽、抗原多肽、以及溶酶体定位蛋白(优选为lamp1)。

13、在本发明的一个具体实施方式中，所述的融合多肽包含seq id no：5所示的氨基酸序列。

14、当然，在实际应用中，融合蛋白可以为信号肽、任一种或多种肿瘤的抗原多肽以及溶酶体定位蛋白。

15、所述的抗原多肽来源于细菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤抗原、肿瘤新抗原或肿瘤细胞抗原。

16、所述的抗原多肽为细菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤抗原、肿瘤新抗原或肿瘤细胞抗原经酶分解后的肽段。其可由mhc呈递至膜表面。

17、所述的抗原自呈递工程化迁移体表达共刺激分子。优选的，所述的共刺激分子表达在抗原自呈递工程化迁移体的膜上。

18、优选的，所述的共刺激分子包括cd28、cd80、cd86、cd40、icam1、icam2、lfa-3、hsa、vcam-1、4-1bb、4-1bbl、ctla-4、pd-1、icos或cd37l中的一种或两种以上。

19、所述的抗原自呈递工程化迁移体表达细胞因子。优选的，所述的细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子-β、生长因子或趋化因子家族中的一种或两种以上的组合；

20、所述的白细胞介素包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35、il-36、il-37或il-38中的一种或两种以上的组合；

21、所述的集落刺激因子包括g-csf、m-csf、gm-csf、multi-csf、scf或epo中的一种或两种以上的组合；

22、所述的干扰素包括ifn-α、ifn-β和/或ifn-γ；

23、所述的肿瘤坏死因子包括tnf-α和/或tnf-β；

24、所述的转化生长因子-β包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgfβ1β2或bmp中的一种或两种以上的组合；

25、所述的生长因子包括egf、pdgf、fgf、hgf、igf-1、igf-ⅱ、lif、ngf、osm、pdecgf、tgf-α或vegf中的一种或两种以上的组合；

26、所述的趋化因子家族包括c-x-c/α亚族、c-c/β亚族、c型亚家族或cx3c亚家族中的一种或两种以上的组合；其中，c-x-c/α亚族包括il-8、gro/mgsa、pf-4、血小板碱性蛋白、蛋白水解来源的产物ctap-ⅲ和β-thromboglobulin、炎症蛋白10或ena-78中的一种或两种以上的组合；c-c/β亚族包括mip-1α、mip-1β、rantes、单核细胞趋化蛋白-1、mcp-2、mcp-3或i-309中的一种或两种以上的组合；c型亚家族包括淋巴细胞趋化蛋白；cx3c亚家族包括fractalkine。

27、优选的，所述的细胞因子为膜结合型细胞因子，例如膜结合型il-12、膜结合型il-15、膜结合型il10、膜结合型il18、膜结合型il2、膜结合型il7或膜结合型il21中的一种或两种以上的组合。

28、其中，所述的膜结合型细胞因子通过将上述的细胞因子改造获得。

29、例如，膜结合型il-12为将il-12两个亚基p35，p40分别与fc6，fc9连接，并与b7分子跨膜区相连形成异源二聚体膜蛋白。或者，将il12两个亚基p35，p40用g4s linker连接，并与b7分子跨膜区相连形成同源二聚体膜蛋白。

30、其中，fc6的氨基酸序列包括：

31、mwelekdvyvvevdwtpdapgetvnltcdtpeedditwtsdqrhgvigsgktltitvkefldagqytchkggetlshshlllhkkengiwsteilknfknktflkceapnysgrftcswlvqrnmdlkfnikssssspdsravtcgmaslsaekvtldqrdyekysvscqedvtcptaeetlpielalearqqnkyenystsffirdiikpdppknlqmkplknsqvevsweypdswstphsyfslkffvriqrkkekmketeegcnqkgaflvektstevqckggnvcvqaqdryynsscskwacvpcrvrs(seq id no：7)；

32、p35的氨基酸序列包括：

33、dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfklvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：8)；

34、p40的氨基酸序列包括：

35、dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysaltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：9)；

36、fc9的氨基酸序列包括：

37、rvipvsgparclsqsrnllkttddmvktareklkhysctaedidheditrdqtstlktclplelhknesclatretssttrgsclppqktslmmtlclgsiyedlkmyqtefqainaalqnhnhqqiildkgmlvaidelmqslnhngetlrqkppvgeadpyrvkmklcillhafstrvvtinrvmgylssa(seq id no：10)；b7分子跨膜区的氨基酸序列包括：

38、tlvlfgagfgavitvvvivviikcfckhrscfrrneasretnnsltfgpe ealaeqtvfl(seq idno：11)。

39、g4s linker的氨基酸序列包含ggggsggggsggggs(seq id no：12)

40、在本发明的一个具体实施方式中，所述的膜结合型il-12还包含信号肽的序列，所述的信号肽的氨基酸序列包括：

41、mhhtsmgikmesqiqvfvfvflwlsgvdg(seq id no：13)

42、在本发明的一个具体实施方式中，所述的膜结合型il-12同源二聚体膜蛋白的连接包括信号肽-p35-g4s linker-p40-b7分子跨膜区。也可以为包含fc6和fc9两个亚基的异源二聚体膜蛋白，其连接分别为：

43、fc6亚基：信号肽-fc6-g4s linker-p35-g4s linker-b7分子跨膜区；

44、fc9亚基：信号肽-fc9-g4s linker–p40-g4s linker-b7分子跨膜区。

45、又例如膜结合型il-15是将il15与il15rα用g4s linker连接形成融合膜蛋白，可以作用于t细胞膜上的il15rβγ。

46、所述的抗原包括细菌、真菌、病毒、肿瘤抗原、肿瘤新抗原或肿瘤细胞抗原。

47、所述的细菌包括球菌、杆菌或螺旋菌。

48、优选的，所述的球菌选自尿素小球菌、肺炎双球菌、乳酸链球菌、四联球菌、尿素生孢八叠球菌或金黄色葡萄球菌。

49、优选的，所述的杆菌选自甲烷短杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状杆菌、双歧杆菌、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、链杆菌或变形杆菌。

50、优选的，所述的螺旋菌选自霍乱弧菌、小螺菌或梅毒螺旋体。

51、所述的真菌选自链霉菌、青霉菌、多粘芽抱杆菌、白地霉、黄曲霉或假丝酵母。

52、所述的病毒选自流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒或人乳头瘤病毒。

53、所述的肿瘤可以为血液瘤或实体肿瘤；优选的，所述的肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。

54、所述的抗原自呈递工程化迁移体可以激活和/或扩增免疫细胞。

55、优选的，所述的抗原自呈递工程化迁移体将抗原多肽呈递至免疫细胞，配合共刺激分子和细胞因子激活和/或扩增免疫细胞。

56、所述的抗原自呈递工程化迁移体分离自来源细胞或产生自组织；

57、优选的，所述的来源细胞可以为离体细胞。

58、优选的，所述的来源细胞为活细胞。

59、所述的来源细胞可以激活和/或扩增免疫细胞。优选的，具有激活和/或扩增免疫细胞的三个信号，第一信号为mhc或其变体、第二信号为共刺激分子，第三信号为细胞因子。具体的，所述的来源细胞表达呈递抗原多肽的mhc或其变体、共刺激分子和细胞因子。

60、优选的，所述的细胞因子为膜结合型细胞因子，且表达在膜上。

61、当然，所述的来源细胞可以为原始具有上述三个信号的功能或者具有激活和/或扩增免疫细胞的功能，也可以具有部分功能或不具有上述三个信号的功能。如果具有部分功能或不具有上述三个信号的功能，则可以通过基因改造后使其具有上述三个信号的功能或者激活和/或扩增免疫细胞的功能。例如，如果来源细胞是肿瘤细胞，其天然带有第一信号，即天然包含呈递抗原多肽的mhc i类分子的功能，故可以通过改造向其加入第二信号和第三信号即可获得可以分离抗原自呈递工程化迁移体的来源细胞。又例如，如果来源细胞是免疫细胞例如树突状细胞，其天然具有mhc i类分子和共刺激信号，则可以向其引入第一信号中的抗原多肽部分和第三信号即细胞因子，即可获得可以分离抗原自呈递工程化迁移体的来源细胞。对于树突状细胞，为了使其也可以呈递mhc ii类分子的抗原多肽，因此也可以通过过表达ciita从而提高mhc ii类分子表达。对于树突状细胞，为了提高其共刺激分子的表达量，也可以使用细胞因子刺激。

62、所述的来源细胞可以为基因改造细胞或天然存在的细胞。

63、所述的来源细胞可以为人或非人动物的细胞。优选人肿瘤细胞或人免疫细胞或人间充质干细胞，可以为原代细胞或细胞系。例如k562细胞等。

64、所述的来源细胞可以为细胞系、原代细胞、经有限传代的细胞和/或类器官。

65、所述的非人动物可以为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。

66、所述的来源细胞包括源自机体的原代细胞或经有限传代的肿瘤细胞，肿瘤基质细胞，和/或肿瘤类器官。

67、所述的抗原或抗原多肽存在于来源细胞的内部和/或表面。

68、在本发明的一个具体实施方式中，所述的来源细胞包括但不限于免疫细胞、肿瘤细胞、hek293细胞(例如hek293t细胞)、成纤维细胞、羊膜细胞、羊膜上皮细胞、胎盘衍生细胞、脐血细胞、内皮细胞、上皮细胞或间充质干细胞。

69、所述的免疫细胞包括淋巴细胞(例如t细胞、b细胞)、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞。

70、所述的间充质干细胞包括但不限于骨髓间充质干细胞、尿液间充质干细胞、口腔间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨膜间充质干细胞或皮肤间充质干细胞。

71、其中，所述的抗原自呈递工程化迁移体还可以作为递送载体或者与待载药物协同增效进行疾病治疗或预防，例如递送或与化疗药、rna药、反义寡聚核苷酸、抗体或免疫调节剂等成分联用。

72、为进一步增加抗原自呈递工程化迁移体在机体内的半衰期，在其膜上修饰抗吞噬蛋白，例如cd47、cd24、mhc-i、pd-l1、stc-1或gd2中的一种或两种以上。

73、为进一步增加抗原自呈递工程化迁移体对器官的靶向性，在其膜上修饰趋化因子受体，例如l-selectin和/或ccr7等。其中，所述的器官优选为脾脏和/或淋巴结。

74、本发明的第二方面，提供了一种基因改造细胞，所述的基因改造细胞含有抗原多肽、表达呈递抗原多肽的mhc或其变体、共刺激分子和细胞因子。

75、所述的基因改造细胞可以产生上述抗原自呈递工程化迁移体。

76、所述的细胞因子为膜结合型细胞因子，且表达在膜上。

77、所述的基因改造细胞可以激活和/或扩增免疫细胞。

78、所述的基因改造细胞包括但不限于肿瘤细胞、免疫细胞、hek293细胞(例如hek293t细胞)、成纤维细胞、羊膜细胞、羊膜上皮细胞、胎盘衍生细胞、脐血细胞、内皮细胞、上皮细胞或间充质干细胞。

79、所述的基因改造细胞可以为人或非人动物的细胞。优选人肿瘤细胞或人免疫细胞或人间充质干细胞，可以为原代细胞或细胞系。例如k562细胞等。

80、所述的基因改造细胞可以为细胞系、原代细胞、经有限传代的细胞和/或类器官。

81、所述的非人动物可以为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。

82、所述的基因改造细胞包括源自机体的原代细胞或经有限传代的肿瘤细胞，肿瘤基质细胞，和/或肿瘤类器官。

83、所述的基因改造细胞包括的mhc或其变体、共刺激分子和细胞因子可以为部分是自身含有的，部分是基因改造的，也可以完全是基因改造的。例如，如果细胞本身含有mhc，则通过基因改造引入共刺激分子和细胞因子；另外，如果只含有mhc i类分子，则可以通过基因工程过表达mhc ii类分子。如果细胞本身含有共刺激分子，则通过基因改造引入mhc和细胞因子；如果细胞本身含有细胞因子，则通过基因改造引入mhc或其变体、共刺激分子。

84、在本发明的一个具体实施方式中，细胞是肿瘤细胞，其天然带有第一信号，即天然包含呈递抗原多肽的mhc i类分子，故可以通过改造向其加入第二信号和第三信号即可获得可以分离抗原自呈递工程化迁移体的基因改造细胞。又例如，细胞是免疫细胞例如树突状细胞，其天然具有mhc i类分子和共刺激信号，则可以向其引入第一信号中的抗原多肽部分和第三信号即细胞因子，即可获得可以分离抗原自呈递工程化迁移体的基因改造细胞。对于树突状细胞，为了使其也可以呈递mhc ii类分子的抗原多肽，因此也可以通过过表达ciita从而提高mhc ii类分子表达。对于树突状细胞，为了提高其共刺激分子的表达量，也可以使用细胞因子刺激。

85、所述的抗原多肽来源于细菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤抗原、肿瘤新抗原或肿瘤细胞抗原。

86、所述的抗原多肽为细菌蛋白、真菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤抗原、肿瘤新抗原或肿瘤细胞抗原经酶分解后的肽段。其可由mhc或其变体呈递至膜表面。

87、所述的抗原或抗原多肽存在于基因改造细胞的内部和/或表面。

88、本发明的第三方面，提供了一种上述的基因改造细胞的制备方法，所述的制备方法包括将编码膜结合型细胞因子的核酸序列导入基因改造细胞中。

89、所述的制备方法包括将编码抗原多肽和/或共刺激分子的核酸导入基因改造细胞中。

90、所述的mhc包括mhc i类分子和/或mhc ii类分子。优选的，所述的基因改造细胞包括将mhc i类分子呈递的抗原多肽和mhc ii类分子呈递的抗原多肽连接为融合蛋白。

91、所述的制备方法包括将编码融合蛋白的核酸导入基因改造细胞中。

92、所述的制备方法包括细胞因子刺激基因改造细胞以提高共刺激分子的表达量。

93、所述的基因改造细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞、hek293细胞(例如hek293t细胞)、成纤维细胞、羊膜细胞、羊膜上皮细胞、胎盘衍生细胞、脐血细胞、内皮细胞、上皮细胞或间充质干细胞。

94、本发明的第四方面，提供了一种基因改造的树突状细胞，所述的基因改造的树突状细胞含有抗原多肽、表达mhc i类分子和/或mhc ii类分子，和，膜结合型细胞因子。

95、所述的基因改造的树突状细胞还表达共刺激分子。优选通过细胞因子进一步刺激共刺激分子的表达。

96、本发明的第五方面，提供了一种基因改造的树突状细胞的构建方法，所述的构建方法包括：

97、a)将编码mhc i类分子呈递的抗原多肽和mhc ii类分子呈递的抗原多肽连接构成的融合蛋白的核酸导入树突状细胞中；优选还包括使所述的树突状细胞过表达ciita；

98、b)将编码共刺激分子的核酸导入树突状细胞中；

99、c)将编码膜结合型细胞因子的核酸导入树突状细胞中。

100、所述的导入包括采用病毒转染。

101、本发明的第六方面，提供了一种基因改造的肿瘤细胞，所述的基因改造的肿瘤细胞含有抗原多肽、表达mhc i类分子和/或mhc ii类分子和共刺激分子。

102、本发明的第七方面，提供了一种基因改造的肿瘤细胞的构建方法，所述的构建方法包括：

103、a)将编码mhc i类分子呈递的抗原多肽和mhc ii类分子呈递的抗原多肽连接构成的融合蛋白的核酸导入肿瘤细胞中；

104、b)将编码共刺激分子的核酸导入树突状细胞中；

105、所述的导入包括采用病毒转染。

106、本发明的第八方面，提供了一种抗原自呈递工程化迁移体的制备方法，所述的抗原自呈递工程化迁移体分离自上述的基因改造细胞或上述的制备方法获得的基因改造细胞。

107、优选的，使上述基因改造细胞或上述来源细胞产生相对位移继而产生源自所述细胞的迁移体。进一步优选还包括分离所述的细胞产生的迁移体。

108、所述的制备方法包括对基因改造细胞或上述来源细胞进行低渗透压处理。例如将基因改造细胞或来源细胞置于低渗缓冲溶液中。

109、优选的，从基因改造细胞中分离抗原自呈递工程化迁移体的方法包括细胞因子刺激以及诱导产生。所述的细胞因子可以为ifnγ，浓度优选为10-30ng/ml。所述的诱导包括加入latrunculin a，latrunculin b，细胞松弛素a，细胞松弛素b，细胞松弛素c，细胞松弛素d和/或细胞松弛素e。优选的，所述的诱导可以为加入latrunculina的k-dpbs。

110、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括：

111、用含有ifnγ的培养基培养基因改造细胞；

112、然后再在含有latrunculina的k-dpbs的培养基中孵育基因改造细胞；优选的，所述的孵育为在摇床中以30-50rpm的转速孵育。

113、再分离获得抗原自呈递工程化迁移体。

114、优选的，所述的分离包括弃上清、用h-kdpbs(75％ kdpbs)洗，再加入h-kdpbs-bsa后离心。其中，所述的离心优选为差速离心，即现在低速离心，再逐渐提高转速离心。在本发明的一个具体实施方式中，所述的离心包括在200-400x g下离心5-20min，取上清，再在400-600x g下离心5-20min，取上清，过滤后继续在10000-30000x g下离心40-80min，弃上清(10000-30000xg下离心40-80min，弃上清可重复1-5次)，沉淀即为抗原自呈递工程化迁移体。其中，所述的过滤可以使用过滤器或挤压器，优选孔径为约30nm至约10000nm。

115、所述的抗原自呈递工程化迁移体膜上富集整合素或其功能片段。

116、所述的方法可以为体内或体外或离体。

117、本发明的第九方面，提供了一种上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞或上述的制备方法获得的抗原自呈递工程化迁移体在激活和/或扩增免疫细胞或制备治疗或预防疾病的产品中的应用。

118、所述的疾病为感染性疾病、自身免疫疾病或肿瘤。

119、所述的感染性疾病包括细菌感染、病毒感染或真菌感染。

120、所述的细菌包括球菌、杆菌或螺旋菌。

121、优选的，所述的球菌选自尿素小球菌、肺炎双球菌、乳酸链球菌、四联球菌、尿素生孢八叠球菌或金黄色葡萄球菌。

122、优选的，所述的杆菌选自甲烷短杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状杆菌、双歧杆菌、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、链杆菌或变形杆菌。

123、优选的，所述的螺旋菌选自霍乱弧菌、小螺菌或梅毒螺旋体。

124、所述的真菌选自链霉菌、青霉菌、多粘芽抱杆菌、白地霉、黄曲霉或假丝酵母。

125、所述的病毒选自流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒或人乳头瘤病毒。

126、所述的肿瘤可以为血液瘤或实体肿瘤；优选的，所述的肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。

127、本发明的第十方面，提供了一种上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞或上述的制备方法获得的抗原自呈递工程化迁移体，与，化疗药和/或免疫调节剂联用在激活和/或扩增免疫细胞或制备治疗或预防疾病的产品中的应用。

128、优选的，所述的化疗药选自烷化剂、抗代谢剂、植物类抗癌药、激素、抗生素或免疫制剂。进一步优选的，所述的化疗药选自紫杉醇、多柔比星、吉西他滨或顺铂。

129、优选的，所述的免疫调节剂包括但不限于免疫检查点抑制剂，例如pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体、tim-3抗体、lag-3抗体或tight抗体中的一种或两种以上。

130、采用抗原自呈递工程化迁移体与免疫检查点抑制剂联用可以达到协同增效的作用，即抗原自呈递工程化迁移体通过对t细胞的激活和扩增实现肿瘤的杀伤，但是无法避免t细胞上的pd-1等导致的t细胞衰竭，因此，免疫检查点抑制剂可以阻断抑制t细胞的信号，实现抑制t细胞的凋亡和衰竭的作用，进一步增强抗原自呈递工程化迁移体对t细胞的激活和扩增。

131、所述的疾病为感染性疾病、自身免疫疾病或肿瘤。

132、所述的感染性疾病包括细菌感染、病毒感染或真菌感染。

133、所述的细菌包括球菌、杆菌或螺旋菌。

134、优选的，所述的球菌选自尿素小球菌、肺炎双球菌、乳酸链球菌、四联球菌、尿素生孢八叠球菌或金黄色葡萄球菌。

135、优选的，所述的杆菌选自甲烷短杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状杆菌、双歧杆菌、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、链杆菌或变形杆菌。

136、优选的，所述的螺旋菌选自霍乱弧菌、小螺菌或梅毒螺旋体。

137、所述的真菌选自链霉菌、青霉菌、多粘芽抱杆菌、白地霉、黄曲霉或假丝酵母。

138、所述的病毒选自流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒或人乳头瘤病毒。

139、所述的肿瘤可以为血液瘤或实体肿瘤；优选的，所述的肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。

140、本发明的第十一方面，提供了一种药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞或上述的制备方法获得的基因改造细胞，以及药学上可接受的辅料。

141、所述的药物组合物还包括与上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞或上述的制备方法获得的基因改造细胞联用的成分。

142、所述的成分可以为任何可以治疗相同疾病或者减轻副作用等的成分。例如所述的成分选自化疗药、rna药、反义寡聚核苷酸、抗体或免疫调节剂。

143、所述的化疗药选自烷化剂、抗代谢剂、植物类抗癌药、激素、抗生素、免疫制剂。优选自紫杉醇、多柔比星、吉西他滨或顺铂。

144、所诉的rna药选自sirna和/或mirna。

145、所述的免疫调节剂包括但不限于免疫检查点抑制剂，例如pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体、tim-3抗体、lag-3抗体或tight抗体中的一种或两种以上。

146、所述的药物或药物组合物可以采用任何合适的给药途径，例如胃肠道给药(例如口服)或非胃肠道给药(例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、器官内、鼻内、眼内、滴注、脑内、鞘内、透皮或直肠内等)途径。

147、所述的药物或药物组合物可以为任何合适的剂型，例如经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型，优选包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、微乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、舌下片剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂或凝胶剂等等。

148、所述药物或药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。

149、所述的药物或药物组合物可以含有重量比为0.01-99.5％(具体如，0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％)的所述抗原自呈递工程化迁移体或所述的基因改造细胞。

150、所述的药物或药物组合物为人用药或兽用药。

151、本发明的第十二方面，提供了一种激活和/或扩增免疫细胞的方法，所述的方法包括将上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞、上述制备方法获得的抗原自呈递工程化迁移体或上述的药物或药物组合物，与免疫细胞接触。

152、所述的方法包括体内和/或体外激活并扩增免疫细胞。

153、优选的，所述的方法包括向需要的个体施加有效量的上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞或上述的药物或药物组合物。

154、本发明的第十三方面，提供了一种治疗或预防疾病的方法，所述的方法包括将上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞或上述的药物或药物组合物，与免疫细胞接触。

155、优选的，所述的方法包括向需要的个体施加有效量的上述的抗原自呈递工程化迁移体、上述的基因改造细胞、上述的制备方法获得的基因改造细胞或上述的药物或药物组合物。

156、所述的疾病为感染性疾病、自身免疫疾病或肿瘤；

157、所述的感染性疾病包括细菌感染、病毒感染或真菌感染。

158、本发明所述的“抗原自呈递xx”代表xx本身具有呈递抗原的能力，其中呈递抗原的形式可以为将抗原水解后呈递多肽分子。

159、本发明所述的“共刺激分子”是参与共刺激信号传递的分子，是免疫细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子及其配体。不同细胞表面表达的共刺激分子不同，例如t细胞表达的是cd28而抗原呈递细胞(apc)则表达b7-1(cd80)和b7-2(cd86)。

160、本发明所述的“细胞因子”是细胞(免疫细胞或非免疫细胞)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。

161、本发明所述的“肿瘤抗原”泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。包括肿瘤特异性抗原(tsa)和肿瘤相关抗原(taa)，其中，tsa存在于肿瘤组织上而不存在于正常组织上的抗原；taa为非肿瘤细胞所持有、正常细胞上也存在的抗原，肿瘤组织中只显示量的变化。

162、本发明所述的“肿瘤新抗原”表示呈现在肿瘤细胞表面的基因突变的抗原，其是真正的外源蛋白，在正常细胞中不表达。

163、本发明所述的“肿瘤细胞抗原”通常是指肿瘤细胞中能引发免疫应答的任何物质。这个定义包括但不限于以含有所有相关抗原的完整肿瘤细胞作为抗原，以及细胞中的任何组分，如浆膜、细胞表面或膜中的蛋白质、或者与细胞表面相连的独特糖类基序。该定义还包括需要对细胞进行特殊处理才能获得的来自于细胞的那些抗原。

164、本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。

165、本发明所述的“药学上可接受的辅料”，包括但不限于载体、赋形剂、稀释剂、润湿剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、矫味剂或防腐剂等中的一种或多种。

166、本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

167、本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的药物或药物组合物的量或剂量。

168、本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。

169、本发明所述的“个体”可以为人或非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。

170、本发明所述的“肿瘤”可以是任何不良的细胞增殖(或本身表现为不良细胞增殖的任何疾病)、赘生物，或不良细胞增殖、赘生物或肿瘤的倾向性或风险增加。其可以是良性或恶性的，也可以是原发性或继发性(转移性)。赘生物可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。进一步优选的，所述的肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤(例如神经胶质瘤)、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤)、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤(例如神经纤维肉瘤)、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。

171、本发明所述的“感染性疾病”包括病毒感染、肺炎伴感染性休克、腹膜炎、菌血症、脓毒症或败血症；所述的病毒感染选自急性病毒感染或慢性病毒感染；优选为流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒(例如hsv-1、ebv)、麻疹病毒、水泡口炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒或人乳头瘤病毒。

172、本发明所述的“自身免疫疾病”包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、克罗恩病、动脉粥样硬化、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。