一种生物炭富里酸复合材料固定化嗜麦芽寡养单胞菌的制备方法及应用

本发明属于环境微生物，具体涉及一种生物炭富里酸复合材料固定化嗜麦芽寡养单胞菌的制备方法及应用。

背景技术：

1、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是一种在自然界中普遍存在的持久性有机污染物。多环芳烃来源广泛，分为人为来源和自然来源。人为来源是最主要的来源，其中包括煤、油、木材等有机物质的不完全燃烧，汽车、飞机的尾气排放和石油泄漏等；自然来源包括火山喷发、森林火灾以及植物体的分解等。无论是自然或者人为引起的不完全燃烧已被确定为多环芳烃的最大贡献者。

2、多环芳烃可以通过吸入、皮肤接触和摄入等方式进入生物体，对动物和人类具有致癌、致畸、致突变和免疫毒性的作用。此外，多环芳烃能吸收紫外和可见光，以激发多环芳烃的电子或能量转移，与氧或其他分子反应形成反应性中间体(例如二环氧化物、醌类和羟烷基衍生物等)，对生物细胞成分造成损害，如细胞膜、核酸或蛋白质等。多环芳烃的毒性随着环的数量增加而增大，随着多环芳烃的分子量增加至4或5个环时，pahs的环境持久性和遗传毒性均增加。

3、低环pahs引起的主要是急性毒性，如萘、菲、蒽等。其中萘是低环多环芳烃的典型代表，其毒性已在动物研究和人类案例研究中被证实，萘毒性的主要靶器官是血液和眼睛，高剂量的摄入会导致肝脏和神经损伤、白内障和视网膜出血、胃肠道窘迫、血红蛋白尿、高铁血红蛋白血症、酮症酸中毒和昏迷等，动物研究表明，长期接触萘可能会增加人类患喉癌和结直肠癌的风险。而高环多环芳烃的毒性，如芘、苯并[a]蒽、苯并[a]芘等表现为遗传毒性，其中，苯并芘是研究最广泛的致癌多环芳烃，被国际癌症研究机构iarc列为1类人类致癌物。

4、微生物修复由于其低成本、不产生二次污染物的优点被广泛应用于多环芳烃污染土壤的修复，微生物修复对土壤中多环芳烃污染的修复是有效的，但在实际的多环芳烃污染场地中，污染物种类复杂、浓度高，微生物需要较长的时间来适应环境，存在微生物在土壤中定殖困难，存活期短，数量低等缺点，并由此导致修复稳定性差、效率低和周期长等问题。因此，如何提高微生物在土壤中定殖率和活性，从而提高其对pahs的修复效率，是微生物修复中面临的主要问题。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种生物炭富里酸复合材料固定化嗜麦芽寡养单胞菌的制备方法及应用，采用生物炭-富里酸复合材料固定化高效多环芳烃降解菌(嗜麦芽寡养单胞菌hct2-6)，制备固定化菌剂，进行了固定化菌剂制备条件的优化，并应用于多环芳烃污染土壤的修复。

2、包括从西北焦化场地污染土壤中筛选出一株多环芳烃高效降解菌，并将其固定生长富里酸-生物炭载体材料上，制备得到固定化菌剂，进一步分析其对多环芳烃污染土壤的修复性能。

3、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

4、一种嗜麦芽寡养单胞菌hct2-6，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心-cgmcc，保藏编号为cgmcc no.29353，保藏日期为2023年12月18日。

5、所述的菌株对多环芳烃具有降解能力，形成菌落呈无色半透明状，表面光滑湿润，边缘规则，中央隆起，略显黄色；呈长杆状，端圆，无芽孢，个体大小1～1.5μm×0.2～0.4μm；菌株hct2-6对芘的最佳降解环境条件为ph＝7.0，30℃，盐度为3％。

6、一种嗜麦芽寡养单胞菌hct2-6的筛选和驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

7、步骤一：通过在灭菌后的无机盐液体培养基中添加含芘30mg·l-1芘的溶液，加入从焦化厂地采集的土壤样品，30℃，150r·min-1，培养7天，富集培养多环芳烃降解菌；

8、步骤二：利用芘作为唯一碳源，在选择性培养基中制备不同浓度的选择性培养基，其中芘浓度呈梯度增加；

9、步骤三：将步骤一富集培养的菌液，在含更高不同浓度芘的培养基中继续培养，逐步增加芘的浓度，最终获得含芘300mg·l-1的富集菌液；

10、步骤四：将步骤三获得的菌液进行梯度稀释后，涂布于含芘300mg·l-1的固体培养基上，30℃培养72～120h，定期观察微生物菌落的生长情况；

11、步骤五：利用分区划线法分离培养生长良好的微生物菌落，直至获得生长良好的单菌落；

12、步骤六：向50ml无菌棕色瓶中，添加1ml 200mg·l-1芘溶液，待有机溶剂完全挥发后，再向其中加入一定量的msm液体培养基，然后向其中接种对数期的菌悬液，接种量为5-10％，使芘的初始含量为20mg·l-1，30℃，150r·min-1培养(避光)14天，采用高效液相色谱法测定溶液中残余芘的量，计算多环芳烃降解率；

13、步骤七：比较分离出的菌株对芘的降解率，筛选出生长良好且降解率最佳的菌株，编号为hct2-6。

14、所述的无机盐培养基为(nh4)2so42g、na2hpo41g、kh2po41g、mgso4·7h2o 0.2g、cacl2·2h2o 0.1g、微量元素溶液1ml、蒸馏水1000ml，ph 7.0。

15、所述的步骤三芘浓度分别为30mg·l-1、90mg·l-1、150mg·l-1、210mg·l-1和300mg·l-1。

16、所述的选择性培养基为取一定量的多环芳烃溶液(丙酮溶解)加入到已灭菌的msm培养基中，待有机溶剂完全挥发后备用。

17、所述的第一阶段驯化培养条件为100ml选择性培养基加入富集后的菌液5-10ml，30℃，150r·min-1培养7d。

18、所述的高效液相色谱(hplc)检测的色谱条件为：采用的hplc型号为agilenthp1100，色谱柱为c18柱(shim-pack vp-ods液相色谱柱，150mm×4.6mm/5μm)，利用紫外检测器，波长设定为220nm和254nm，设置流速为1ml·min-1，柱温为30℃，进样量为10μl，流动相为乙腈和超纯水90:10，芘(pyr)的保留时间为4.2±0.1min。

19、一种嗜麦芽寡养单胞菌hct2-6应用于生物炭富里酸复合材料固定化菌剂的制备，其特征在于，包括以下步骤；

20、步骤一：采用限氧热解法制备小麦秸秆生物炭，限氧热解法为：将小麦秸秆粉末放入坩埚中，在500-700℃下通入氮气进行厌氧炭化，持续2-3小时，当温度降到室温之后，将其取出得到富里酸负载小麦秸秆生物炭；

21、步骤二：采用富里酸和小麦秸秆生物炭为材料，使富里酸吸附于生物炭材料的孔径中，制备固定化载体，载体制备方法为：2-4g富里酸溶于0.1mol·l-1的nacl溶液，调节ph为7-7.2；取0.4-1g小麦秸秆生物炭加入100ml富里酸溶液中，25℃，150r·min-1避光振荡7d，离心，冷冻干燥，研磨过百目筛，备用；

22、步骤三：将载体与菌悬液混合，进行摇床培养，制备固定化菌剂；固定化菌剂的制备方法为：向100ml固定化培养基中加入一定量的上述固定化载体材料，121℃灭菌20min后，以2-5％的接种量接入对数生长期的hct2-6菌悬液，摇床(30℃、150r·min-1)培养，使菌体吸附生长于固定化载体上，培养2d后，将培养好的混合物分装于离心管中，在6000-8000r·min-1离心8-10min，倒掉上层培养基液体，用0.85％生理盐水洗涤下层沉淀，洗涤三次后离心得到的下层固体沉淀即固定化菌剂。

23、在选择性培养基中培养从焦化厂地区采集的土壤样品，以富集多环芳烃降解菌源。在含芘的选择性培养基中进行第一阶段的菌液培养，以驯化多环芳烃降解菌，持续培养7天。利用第一阶段驯化的菌液，在含不同浓度芘的培养基中继续培养，逐步增加芘的浓度，最终获得含芘300mg·l-1的富集菌液。

24、通过稀释方法制备不同稀释度的菌悬液。将不同稀释度的菌悬液涂布在含芘300mg·l-1的固体培养基上，利用分区划线法分离培养较好的微生物菌落，直至获得纯的单一菌落为止。在芘溶液和msm液体培养基中，接种特定量的单一菌落制备的菌悬液，在特定条件下(30℃、150r·min-1、避光)培养14天后，测定溶液中残余芘的量。根据芘的降解性能效果，最终得到对芘也有较高的去除率的hct2-6。

25、所述的固定化培养基为蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸粉1.5g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2，121℃灭菌20min。

26、所述的固定化菌剂是以生物炭富里酸复合材料为载体，负载多环芳烃降解菌株。

27、所述的固定化菌剂在土壤多环芳烃污染环境治理中的应用。

28、所述的多环芳烃为萘nap、芘pyr、苯并[a]蒽baa、苯并[a]芘bap。

29、所述的固定化菌剂的使用方法为：向无菌棕色瓶中加入2g老化后多环芳烃污染土壤，使土壤含水率保持于50-60％左右。将制备的20mg固定化菌剂加入老化后多环芳烃污染土壤中，在摇床(30℃、150r·min-1)中避光振荡培养，30d后取样，测定土壤中多环芳烃的残余量，用hplc测定溶液中多环芳烃浓度。

30、本发明具有以下的有益效果和优点：

31、1.所筛选出的嗜麦芽寡养单胞菌hct2-6菌株表现出优异的多环芳烃(尤其是芘)的降解能力。在经过优化的培养条件下，该菌株能够有效降解污染物，提升土壤修复的效率。

32、2.固定化技术能够保护菌株在环境中的活性和稳定性，避免了自由菌在土壤环境中易被冲刷和环境压力影响的问题，提高了菌株在复杂环境中的生存率和降解持久性。

33、3.采用生物炭和富里酸作为载体材料，这些材料本身具有良好的环境兼容性和可再生性，避免了传统化学药剂可能带来的二次污染问题，是一种绿色环保的修复技术。

34、4.本发明所描述的固定化菌剂制备方法相对简便，操作步骤明确，条件可控，适合大规模生产和应用，降低了技术实施的难度和成本。