一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法

本发明属于生物，具体涉及一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法。

背景技术：

1、原始生殖细胞（primordial germ cells，pgcs）作为生殖细胞的祖细胞，由于其种系传递能力广泛应用于转基因动物制备、再生医学、种质资源保护等领域。鸟类pgcs由于其特有的随血液循环系统迁移至生殖嵴的能力受到越来越多科研人员的关注，具有广阔的应用前景。迄今为止，小鼠等哺乳动物的pgcs由于生物学特性调节机制完善，其pgcs可在体外长期高效扩增且不丢失pgcs特性。然而由于物种之间的差异，哺乳动物的培养方案无法完全应用于鸟类pgcs，加之鸟类pgcs生物学特性调节相关研究开展相对较晚，目前鸟类pgcs体外特性维持仍是问题，这也导致体外获取pgcs数量不足限制了进一步的实际应用。因此鸟类pgcs特性调节机制研究应当成为关注重点，以期为发生研究、具体应用提供理论基础与生物材料。

2、类泛素化（neddylation）与泛素化相似，是一种重要的蛋白翻译后修饰。在类泛素化修饰过程中，神经前体细胞表达发育下调因子8（neural precursor cell-expresseddevelopmentally down-regulated 8，nedd8）前体经历水解暴露双甘氨酸残基，继而通过nedd8激活酶e1、nedd8结合酶e2和nedd8连接酶e3三级酶联催化反应连接到底物蛋白赖氨酸残基上。相较泛素化的多样化功能，类泛素化的功能较为单一，主要是改变底物蛋白的活性。类泛素化在细胞分化、个体发育、疾病进展等过程发挥重要功能。王等（王亮.neddylation（类泛素化）对维持空肠平滑肌稳态的作用[d].南昌大学,2023.doi:10.27232/d.cnki.gnchu.2022.000619.）通过敲除nae1阻断类泛素化修饰后，小鼠胃肠道平滑肌收缩异常并引发严重，说明类泛素化维持空肠平滑肌稳态。龙等（龙果. mln4924通过抑制类泛素化通路上调人肺腺癌a549细胞中pd-l1的表达[d].西南医科大学,2024.doi:10.27215/d.cnki.glzyu.2023.000175.）发现抑制类泛素化修饰可以上调表达pd-l1，为非小细胞肺癌提供新的治疗思路。在贾等（贾晓青,孙晓寅,蒋蓓琦,等.类泛素化neddylation修饰调控乳腺癌中核纤层蛋白lamin b1的表达[j].中国癌症杂志,2022,32(06):535-541.doi:10.19401/j.cnki.1007-3639.2022.06.008.）的研究中，类泛素化修饰被证明以p53依赖途径抑制lamin b1表达，在乳腺癌治疗上有良好的应用潜力。cullin-ring连接酶（cullin-ring ligases，crls）是目前已发现最大的泛素连接酶e3家族，介导大约20%的蛋白泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，ups）降解过程。cullin蛋白作为crls的骨架组分，是类泛素化的主要底物。有趣的是，cullin蛋白发挥支架功能的前提是经历类泛素化修饰获得活性。因此有许多研究通过改变蛋白的类泛素化修饰水平间接调控泛素化修饰。本课题前期对escs和pgcs的蛋白组进行分析，发现crls相关蛋白显著上调，说明pgcs发生过程中crls催化蛋白泛素化十分活跃。此外，与蛋白酶体形成相关go条目被富集。具体分析发现与蛋白酶体形成相关蛋白adrm1、psmf1、psmc3、psmc6都发生显著上调。最重要的是，我们关注到参与类泛素化修饰途径的关键蛋白在pgcs发生过程中呈现动态变化，说明类泛素化水平对于鸡pgcs是特异的。

3、为了明确类泛素化对鸡pgcs特性的影响，需要开发新的研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，解决体外获取数量不足的问题并为鸡pgcs发生机制研究和具体应用提供理论基础和生物材料。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，能有效解决解决缺乏研究类泛素化修饰调节鸡pgcs特性的问题和体外获取鸡pgcs数量不足的问题。

2、技术方案：一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，包括以下步骤：

3、（1）采用vii-31和mln4924处理pgcs；

4、（2）pgcs生物学特性的检测。

5、优选的，步骤（1）的具体过程为：根据浓度计算用dmso分别溶解vii-31和mln4924制备母液，将母液与生长状态良好的pgcs混合后接种至接种板，在37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养24 h。

6、优选的，步骤（2）中的生物学特性包括形态学观察、细胞活率、细胞凋亡率、基因检测和数据处理。

7、进一步的，形态学观察的具体过程为：在倒置显微镜下观察vii-31和mln4924处理后的pgcs的形态。

8、进一步的，检测细胞活率的具体过程为：将vii-31和mln4924处理后的pgcs重新接种至接种板，在每孔中加入cck-8，于37 ℃避光孵育2 h，在酶标仪上检测450 nm处的吸光值。

9、进一步的，检测细胞凋亡率的具体操作为：将vii-31和mln4924处理后的pgcs进行洗涤，离心得到细胞沉淀，加入100 μl 1×binding buffer，随后加入5 μl annexinv-fitc和10 μl pi staining solution，避光室温反应10~12 min，然后用流式细胞仪检测。

10、进一步的，基因检测包括 blimp1、 ddx4、 cxcr4和 oct4。

11、更进一步的，基因检测作用引物序列如seq id no.3-10所示。

12、进一步的，数据处理采用spss 19.0和graphpad prism 6进行显著性分析并生成图表。

13、有益效果：1）本发明能够高效研究类泛素化对鸡pgcs的调节作用；

14、2）简便高效，特异性强；

15、3）本发明为研究鸡pgcs生物学特性维持提供理论基础，以制定新的长期培养扩增方案，解决体外获取鸡pgcs数量不足的问题，为鸡pgcs高效应用作铺垫；

16、4）本发明使用范围广，可推广到其他物种类泛素化调节不同细胞特性的研究，便于探索类泛素化修饰在特定生物学过程中的调控作用以导向实际细胞、组织层面的应用，在这些领域具有较大的推广生产潜能和经济效益。

1.一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程为：根据浓度计算用dmso分别溶解vii-31和mln4924制备母液，将母液与生长状态良好的pgcs混合后接种至接种板，在37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养24 h。

3.根据权利要求1所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于：步骤（2）中的生物学特性包括形态学观察、细胞活率、细胞凋亡率、基因检测和数据处理。

4.根据权利要求3所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，形态学观察的具体过程为：在倒置显微镜下观察vii-31和mln4924处理后的pgcs的形态。

5. 根据权利要求3所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，检测细胞活率的具体过程为：将vii-31和mln4924处理后的pgcs重新接种至接种板，在每孔中加入cck-8，于37 ℃避光孵育2 h，在酶标仪上检测450 nm处的吸光值。

6. 根据权利要求3所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，检测细胞凋亡率的具体操作为：将vii-31和mln4924处理后的pgcs进行洗涤，离心得到细胞沉淀，加入100 μl 1×binding buffer，随后加入5 μl annexinv-fitc和10 μlpi staining solution，避光室温反应10~12 min，然后用流式细胞仪检测。

7.根据权利要求3所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，基因检测包括blimp1、ddx4、cxcr4和oct4。

8. 根据权利要求7所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，基因检测作用引物序列如seq id no.3-10所示。

9. 根据权利要求3所述的一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，其特征在于，数据处理采用spss 19.0和graphpad prism 6进行显著性分析并生成图表。