白菜根肿病感病基因BrSWEET1b及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程，特别是涉及白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b及其应用。

背景技术：

1、白菜（ brassica rapal. syn. b. campestrisl.）是十字花科（cruciferae）芸薹属（ brassica）植物，该属植物是世界第二大植物油来源，也是世界第三大蔬菜来源。目前，由芸薹根肿菌（ plasmodiophora brassicaeworonin）侵染造成的根肿病对世界十字花科作物的生产构成严重威胁。全球已有60多个国家报道了根肿病的发生，其中包括亚洲的中国、日本、韩国、印度和老挝；北美洲的美国和加拿大；南美洲的巴西、墨西哥和哥伦比亚；欧洲的卢森堡、法国、捷克共和国和瑞典；大洋洲的澳大利亚等。受根肿菌侵染的植株由于其根组织的膨大，影响了根系对矿质元素和水分的吸收和运输，因此，植株地上部会表现出矮化和枯萎症状，叶片发红、褪绿、坏死和脱落，植物提早开花，严重影响芸薹属作物的产量和质量；田间试验结果表明，根肿病可造成油菜产量减少30%，而在受害严重的情况下甚至可以导致产量损失80%-90%。

2、研究表明，病原体诱导的侵染通过激活特定的糖转运蛋白或 sweet基因来利用寄主植物中的糖资源，这些蛋白决定了植物对病原菌的易感性。例如，zhang等人发现，在芸薹属植物感染的根系中，6个油橄榄 sweets基因显著上调，这种上调的基因表达增强了糖向病原体的输送。在其他物种中也报告了类似的发现，其中 sweets家族已被确定为易感因素；例如， atsweet4/15对芸薹的发育至关重要，灰芽孢杆菌感染后 atsweet4/15/17上调， ossweet11/14转录本在稻黄单胞菌感染期间增加。根据既往研究，包括转录组测序和全基因组关联研究，在 b. rapa中发现了大量响应根肿菌感染的差异表达的 sweets家族基因，表明其参与糖转运和病原体感染。

3、因此， sweets家族基因作为易感因素参与到植物与病原菌的互作过程中。 sweets蛋白在植物抗病、抗逆研究中具有巨大的潜在利用价值，可以通过分子生物学手段创制抗病抗逆的新种质，进而培育出抗病抗逆的新品种。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b，发现该基因与十字花科根肿病关系密切，能将该基因应用于白菜或其他十字花科蔬菜育种中。

2、第一方面，提供白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b，所述相关基因为候选基因，所述相关基因 brsweet1b的核苷酸序列包括：

3、（1）所述核苷酸序列如seq id no.1所示；或

4、（2）seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

5、（3）在严格条件下与（1）限定的dna序列杂交的核苷酸序列。

6、于一实施例中，包含所述的白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b的生物材料，所述生物材料包括表达载体、表达盒，宿主细胞、工程菌中的至少一种。

7、第二方面，提供白菜 brsweet1b基因沉默载体的构建方法，包括如下步骤：

8、预测权利要求1所述白菜 brsweet1b基因的沉默序列，沉默序列如seq id no.2所示；

9、双酶切ptrv2载体，得到线性化的ptrv2载体；

10、将沉默序列扩增，将扩增后的沉默序列和线性化的ptrv2载体同源重组连接，将连接产物转化，得到白菜 brsweet1b基因沉默载体。

11、于一实施例中，沉默序列扩增的特异引物如seq id no.3、seq id no.4所示。

12、第三方面，提供白菜 brsweet1b基因过表达载体的构建方法，包括如下步骤：

13、双酶切pfgc1008-egfp载体，得到线性化的pfgc1008-egfp载体；

14、设计特异引物将权利要求1所述白菜 brsweet1b基因的核苷酸序列扩增，将扩增后的序列和线性化的pfgc1008-egfp载体同源重组连接，将连接产物转化，得到白菜 brsweet1b基因过表达载体；

15、其中，特异引物如seq id no.12、seq id no.13所示。

16、于一实施例中，包括如下步骤：

17、双酶切pfgc5941-egfp载体，得到线性化的pfgc5941-egfp载体；

18、设计特异引物将权利要求1所述白菜 brsweet1b基因的核苷酸序列扩增，将扩增后的序列和线性化的pfgc5941-egfp载体同源重组连接，将连接产物转化，得到白菜 brsweet1b基因亚细胞定位载体；

19、其中，特异引物如seq id no.14、seq id no.15所示。

20、第四方面，提供一种所述的白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b或所述的生物材料在筛选抗病植物和/或调控植物抗病功能中的应用。

21、第五方面，提供一种所述的白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b或所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。

22、第六方面，提供一种所述的白菜根肿病感病相关基因 brsweet1b或所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。

23、第七方面，提供适用于白菜 brsweet1b基因的突变体材料构建方法，包括如下步骤：

24、dna快速提取法提取拟南芥dna，利用该dna和三引物法pcr获得适用于白菜 brsweet1b基因的突变体材料，其中，三引物法的特异引物如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11所示；白菜 brsweet1b基因为所述的白菜 brsweet1b基因。

25、进一步的，所述根肿病为芸薹根肿菌引起的根肿病。

26、本发明的有益效果是：

27、本发明提供的白菜 brsweet1b序列如seq id no.1所示。通过农杆菌介导法将该基因导入拟南芥中，获得白菜 brsweet1b异源过表达的转基因拟南芥株系，结果发现，在抗病性鉴定实验中， brsweet1b在拟南芥中直系同源基因 atsweet1的t-dna插入突变体材料比野生哥伦比亚型拟南芥更加抗病， brsweet1b的异源过量表达可以促进根肿菌侵染拟南芥根部引起的根肿病发病更加严重。这表明了白菜 brsweet1b与十字花科根肿病关系密切，将该基因应用于白菜类蔬菜或其他十字花科蔬菜育种，具有良好的应用前景。

28、本技术还提供了白菜 brsweet1b基因沉默载体、过表达载体、亚细胞定位载体的构建方法，以及适用于白菜 brsweet1b基因的突变体材料构建方法，构建的方法特异性高，更适合本技术提供的白菜 brsweet1b序列所应用的生物材料。