一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因SNP标记、检测引物及其应用

本发明属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因snp标记、检测引物及其应用。

背景技术：

1、南美白对虾，学名凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)，是全球养殖规模最大的对虾，原产于西半球从墨西哥西南至秘鲁西部的太平洋沿岸，尽管在我国缺乏本土野生资源，但是迄今为止我国已育成了拥有品种权的南美白对虾新品种共12个，选育性状集中在生长速度、耐低温、抗弧菌病等方面。我国目前是全球南美白对虾是产量最高的养殖大国，依据《2023年中国渔业统计年鉴》，2022年全国海水养殖南美白对虾产量134万吨，占我国海水养殖对虾总产量的81％。

2、目前在工农业的发展需求、工业废水、生活污水的排放、化肥的使用日益增加以及高密度养殖业的发展前提下，水体中氨和亚硝酸盐的累积正在加剧了。当凡纳滨对虾处于高亚硝酸盐的环境中时，机体自身发生氧化损伤，从而导致死亡，这种环境异常极大地制约着凡纳滨对虾养殖业的健康发展，因此开展凡纳滨对虾抗高亚硝酸盐胁迫性状的育种工作能够为养殖户减少损失，同时为凡纳滨对虾健康育种提供理论支撑。

3、传统的选育方法周期长、效率低，随着现代生物技术和遗传学技术在水产领域的快速转化，以性状相关功能基因为基础的分子标记技术成为水产遗传育种的关键技术之一。单核苷酸多态性(snp)作为第三代分子标记，在基因组中的分布密度很高。因snp具有快速、规模化筛选、易于分型、高遗传稳定性等优点，已经广泛应用于水产遗传育种中。

技术实现思路

1、本发明旨在通过挖掘与凡纳滨对虾抗高亚硝酸盐相关的snp标记，并通过应用该标记建立一种用于凡纳滨对虾分子标记辅助抗逆育种的方法，加快凡纳滨对虾抗逆优良品种的选育进程。

2、本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因snp分子标记，述的snp分子标记位于如seq id no.2所示序列第402bp位点处，突变类型为c/c纯合、a/a纯合和a/c杂合。

3、本发明发现凡纳滨对虾血蓝蛋白f链基因(lv-hemocyanin fchain-like)(其核苷酸序列如seq id no.1所示)位点的多态性。该位点位于血蓝蛋白f链基因1611bp位置，该碱基为a或c，此处为c/c纯合的凡纳滨对虾在高亚硝酸盐胁迫条件下，存活率显著高于a/a纯合和a/c杂合。该snp位点为c/c基因型的凡纳滨对虾个体，具有很好的抗逆能力，因此，该snp分子标记的抗逆优势基因型为c/c纯合基因型。

4、因此，本发明提供了区分凡纳滨对虾抗亚硝酸盐能力的snp分子标记，其位于凡纳滨对虾血蓝蛋白f链基因(其核苷酸序列如seq id no.2所示)cds区域的118bp位点处，突变类型为c/c纯合、a/a纯合和a/c杂合。

5、本发明的第二个目的是提供一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因snp分子标记的检测引物，其包括以下引物：

6、lv-hcf-f：5’-atcaccagcaccaccattct-3’；

7、lv-hcf-r：5’-gcctatctatctgcctatcg-3’。

8、所述的检测引物扩增稳定、重复性好。扩增产物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的snp位点位于扩增产物序列的118bp位置，为a到c的突变，该标记的抗亚硝酸盐优势基因型为c/c纯合基因型。

9、本发明的第三个目的是提供一种检测试剂盒，其包含上述的检测引物。

10、本发明的第四个目的是提供上述的snp分子标记、上述的检测引物或上述的检测试剂盒在区分凡纳滨对虾抗亚硝酸盐能力中的应用。

11、优选地，所述的snp分子标记为c/c纯合基因型的凡纳滨对虾抗逆能力显著高于a/a纯合和a/c杂合基因型。

12、本发明的第五个目的是提供上述的snp分子标记、上述的检测引物或上述的检测试剂盒在抗亚硝酸盐性状凡纳滨对虾亲虾个体鉴定、群体选育或耐亚硝酸盐凡纳滨对虾高抗品系维持中的应用。

13、本发明的第六个目的是提供鉴别上述的snp分子标记的产品在制备区分凡纳滨对虾抗亚硝酸盐能力的试剂中应用。

14、本发明的第七个目的是提供一种凡纳滨对虾抗亚硝酸盐品种的选育方法，其包括以下步骤：

15、a、提取待测凡纳滨对虾基因组dna；

16、b、利用上述的检测引物lv-hcf-f和lv-hcf-r对待测凡纳滨对虾基因组dna进行pcr扩增；

17、c、对扩增产物进行测序，确定snp标记的基因型，选择a/a纯合基因型个体作为后备亲本进行凡纳滨对虾抗亚硝酸盐品种育种。

18、优选地，所述的pcr扩增的反应体系包括：2×taq pcr master mix 15μl、正向引物2μl、反向引物2μl、dna模板1μl，其余由无菌双蒸水补足至30μl。

19、优选地，所述的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃再延伸5分钟。

20、优选的，所述的pcr扩增产物，采用abi公司3730xl dnaanalyzer测序仪进行sanger测序。

21、本发明的优点：

22、本发明提供了一种有效地开展凡纳滨对虾分子标记辅助抗亚硝酸盐性状遗传选育的方法，该方法效率高，操作简单，选育个体基因型稳定，不发生遗传分化，可显著加快抗病育种进展，对提高凡纳滨对虾抗病养殖具有重要指导意义。

1.一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因snp分子标记，其特征在于，所述的snp分子标记位于如seq id no.2所示序列第402bp位点处，突变类型为c/c纯合、a/a纯合和a/c杂合。

2.一种凡纳滨对虾亚硝酸盐抗逆性状相关基因snp分子标记的检测引物，其特征在于，包括以下引物：

3.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的检测引物。

4.权利要求1所述的snp分子标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求3所述的检测试剂盒在区分凡纳滨对虾抗亚硝酸盐能力中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的snp分子标记为c/c纯合基因型的凡纳滨对虾抗逆能力显著高于a/a纯合和a/c杂合基因型。

6.权利要求1所述的snp分子标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求3所述的检测试剂盒在抗亚硝酸盐性状凡纳滨对虾亲虾个体鉴定、群体选育或耐亚硝酸盐凡纳滨对虾高抗品系维持中的应用。

7.鉴别权利要求1所述的snp分子标记的产品在制备区分凡纳滨对虾抗亚硝酸盐能力的试剂中应用。

8.一种凡纳滨对虾抗亚硝酸盐品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增的反应体系包括：2×taqpcrmaster mix 15μl、正向引物2μl、反向引物2μl、dna模板1μl，其余由无菌双蒸水补足至30μl。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃再延伸5分钟。