一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂、试剂盒和方法与流程

本发明属于原生质体分离，具体涉及一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂、试剂盒和方法。

背景技术：

1、杨树是我国主要的造林树种，在生态环境建设、工业生产、房屋建造、家具制造等方面具有不可替代的作用。近年来，作为模式树种，杨树生物技术发展迅速。通过杂交育种、分子生物学育种等手段培育抗性强、生长速度快的杨树新品种是杨树育种目标。其中，在限制植物生长的各种环境胁迫中，以干旱胁迫最为常见和严重。研究植物响应干旱胁迫的分子机制，通过生物技术手段，改良林木品质，提高林木抗逆性，对实现林业快速发展具有重要的生物学意义。

2、气孔由一对肾形保卫细胞组成，分布于叶片表面。气孔是进行气体交换及水分蒸发的门户。气孔可以响应多种外界刺激，尤其在响应逆境胁迫中具有重要作用。植物处于干旱状态时，在保卫细胞中，aba诱导产生h2o2，作为重要的第二信使，h2o2激活ca2+通道，促使气孔关闭。保卫细胞在植物响应干旱胁迫中具有重要作用。为了排除其他细胞的干扰，分离植物保卫细胞，获得保卫细胞原生质体是研究气孔运动的有效方法。植物原生质体是指去除细胞壁的细胞，保卫细胞原生质体(guard cellprotoplasts，gcps)是研究气孔运动分子机制、膜透性和离子转运过程的重要材料。

3、目前，在草本模式植物拟南芥中具有成熟的保卫细胞原生质体分离方法，在蚕豆等其他植物中也有分离保卫细胞原生质体的方法。然而在多年生树种杨树中分离保卫细胞原生质体的技术尚未报道，尤其是银白杨，银白杨具有叶片脆软的特性，因此采用常规通过撕取叶表皮条的方式并不能获取保卫细胞，另外，银白杨叶片背面叶表皮微毛发达，使得保卫细胞被覆盖，这也造成分离保卫细胞较为困难。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂、试剂盒和方法。本发明所述试剂能够实现银白杨保卫细胞原生质体的高效分离。

2、本发明提供了一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂，所述试剂包括酶液i和酶液ii；所述酶液i包括：质量百分含量为0.5％的纤维素酶r-10、质量百分含量为0.02％的离析酶r-10、0.25m的d-甘露醇、20mm的kcl、20mm的mes、10mm的cacl2、体积百分含量为0.2％的bsa和水；

3、所述酶液ii包括：质量百分含量为1.5％的纤维素酶r-10、质量百分含量为0.02％的离析酶r-10、0.4m的d-甘露醇、20mm的kcl、20mm的mes、10mm的cacl2、体积百分含量为0.2％的bsa和水。

4、优选的是，所述试剂还包括清洗液；所述清洗液包括：0.4m的d-甘露醇、20mm的kcl、20mm的mes、10mm的cacl2和水。

5、本发明还提供了一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂和过滤材料。

6、本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒的分离银白杨保卫细胞原生质体的方法，包括以下步骤：

7、1)将银白杨叶片与酶液i混合进行第一消化，第一过滤，得到第一消化处理的叶表皮；

8、2)对第一消化处理的叶表皮进行清洗，孵育，第二过滤，得到清洗后的叶表皮；

9、3)将清洗后的叶表皮与酶液ii混合进行第二消化，第三过滤，取滤液，离心取沉淀，得到保卫细胞原生质体。

10、优选的是，所述银白杨叶片在与酶液i混合前，处理成叶片条。

11、优选的是，所述第一消化的时间为0.5～1.5h；所述第二消化的时间为1～3h。

12、优选的是，所述第一消化和所述第二消化分别进行水平震荡，所述水平震荡的速度分别为40次/min。

13、优选的是，所述第一过滤和所述第二过滤为过200目筛网；所述第三过滤为过300～800目筛网。

14、优选的是，所述孵育的时间为30min。

15、优选的是，所述离心的条件为100g离心5min。

16、本发明提供了一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂。本发明所述试剂能够实现银白杨保卫细胞原生质体的高效分离，获得的原生质体纯度高、完整(活力高)且数量多。试验结果表明，本发明试剂相对于普通酶液，能够获得更高纯度的保卫细胞原生质体，且原生质体完整。

1.一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂，其特征在于，所述试剂包括酶液i和酶液ii；所述酶液i包括：质量百分含量为0.5％的纤维素酶r-10、质量百分含量为0.02％的离析酶r-10、0.25m的d-甘露醇、20mm的kcl、20mm的mes、10mm的cacl2、体积百分含量为0.2％的bsa和水；

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括清洗液；所述清洗液包括：0.4m的d-甘露醇、20mm的kcl、20mm的mes、10mm的cacl2和水。

3.一种分离银白杨保卫细胞原生质体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述试剂和过滤材料。

4.基于权利要求1或2所述试剂或权利要求3所述试剂盒的分离银白杨保卫细胞原生质体的方法，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述银白杨叶片在与酶液i混合前，处理成叶片条。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一消化的时间为0.5～1.5h；所述第二消化的时间为1～3h。

7.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述第一消化和所述第二消化分别进行水平震荡，所述水平震荡的速度分别为40次/min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一过滤和所述第二过滤为过200目筛网；所述第三过滤为过300～800目筛网。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为30min。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为100g离心5min。