Septin9基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒的制作方法

本发明属于生物，具体涉及septin9基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒。

背景技术：

1、sept家族是一组高度保守的gtp结合蛋白，广泛存在于人类细胞中，在细胞分裂过程中提供结构支撑。septin9基因属于sept基因家族的一员，位于人类染色体17q25.3，是调控细胞正常生长的基因之一。其编码的蛋白位于胞质，是一种高度糖基化的蛋白，是p53介导的细胞周期调控的下游信号，可使异常的细胞停滞在g2期，阻止细胞增殖。septin9启动子异常甲基化可以抑制转录，引起g2/m检查点调控发生紊乱，导致细胞异常增殖。在细胞质分裂、细胞极化、囊泡运输和细胞膜构建等多个生物过程发挥重要作用。

2、sept9通过编码gtp结合蛋白，参与肌动蛋白动力学、细胞骨架重塑、囊泡运输和胞吐作用。在健康组织中甲基化sept9（msept9）水平低，而在结直肠癌等病变组织中显著升高，因此可通过检测血浆中的msept9水平识别结直肠癌患者。结直肠癌（crc）是常见的胃肠道恶性肿瘤，世界范围内的流行病学调查资料表明，大肠癌在各类恶性肿瘤中的发病率居第3位。是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位；直肠癌发病率仅次于胃和食管癌。随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率明显上升，严重威胁着人类健康。结肠直肠癌早期症状不明显，随着肿瘤增大而表现出排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则发展为贫血、体重减轻等全身症状。 crc早期诊断试剂盒的检测靶点就是sept-v2这一区域。异常甲基化的septin9基因不仅存在于结直肠癌组织和患者外周血中，而且还与乳腺癌、卵巢癌、白血病和淋巴癌等密切相关。此外，结直肠癌患者血浆中发现的apc、shp1、e-cadherin、er、septin9、sema3b和3ost2等7种高频率甲基化的基因中，只有septin9基因在非结直肠癌患者的血浆中是呈显著性低频率甲基化，这说明septin9可以作为结直肠癌早期的肿瘤标志物。另一方面，增强septin9 mrna及蛋白的表达通过使用去甲基化制剂可使抑癌基因重获作用，其干扰下可能减少septin9异常甲基化的发生，并且联合应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂后，抑制肿瘤细胞生长的效果更显著。

3、dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，s-腺苷甲硫氨酸的甲基（-ch3）共价结合到dna分子的胞嘧啶（c）碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mc），而并不改变dna的序列。众多研究表明，sept9基因启动子甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关，它是结直肠癌特异的分子标记。因此，检测结直肠癌sept9基因启动子的甲基化状态，对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。

4、虽然肠镜检查是识别和切除结直肠病变（包括息肉）的标准方法，但它具有一定的侵入性和不适感。患者需要进行肠道准备和清空肠道，这可能给患者带来不适和负担。此外，肠镜检查还可能出现并发症，如出血或穿孔，进一步增加了患者的风险。粪便潜血检测是一种无侵入性的筛查方法，但其灵敏度和特异性并不理想。它可能无法检测到所有结直肠癌病例，且可能因饮食、药物等因素产生假阳性结果。因此，需要开发新的产品以满足市场的需求。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种septin9基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒，其仅需要抽取外周静脉血，故其患者依从性较高；利用ddpcr检测方法，对结直肠癌的早期筛查具有无创性，检测灵敏度高。

2、技术方案：第一方面，本发明提供septin9基因甲基化检测引物探针体系，包括扩增引物对、用于检测甲基化的基因的探针a和用于检测未甲基化的基因的探针a’；所述扩增引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示，探针a的核苷酸序列如seq id no.3所示，探针a’的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述探针a和探针a’的5’端设有不同的报告荧光基团：

3、seq id no.1：tggtgggggtgttagttgtag；

4、seq id no.2：acaaccaaacaaaattctctatcacc；

5、seq id no.3：ttaatttttgtaggcgtagag；

6、seq id no.4：gtttaatttttgtaggtgtagag。

7、优选的，各引物应用于pcr反应中的终浓度为900nm，各探针应用于pcr反应中的终浓度为250nm。

8、优选的，所述报告荧光基团为fam或vic。

9、优选的，septin9基因甲基化的概率=报告探针a所带荧光的拷贝数÷（报告探针a所带荧光的拷贝数+报告探针a’所带荧光的拷贝数）。

10、第二方面，本发明提供一种含有第一方面所述的引物探针体系的septin9基因甲基化检测试剂盒。

11、有益效果：本发明septin9基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒，其仅需要抽取外周静脉血，故其患者依从性较高；利用ddpcr检测方法，对结直肠癌的早期筛查具有无创性，检测灵敏度高。本发明试剂盒操作相对快捷，避免侵入性操作带来的不适和风险，能够精准识别，减少假阳性和假阴性的发生，适用人群广泛。

1.septin9基因甲基化检测引物探针体系，其特征在于：包括扩增引物对、用于检测甲基化的基因的探针a和用于检测未甲基化的基因的探针a’；

2.根据权利要求1所述的septin9基因甲基化检测引物探针体系，其特征在于：各引物应用于pcr反应中的终浓度为900nm，各探针应用于pcr反应中的终浓度为250nm。

3.根据权利要求1所述的septin9基因甲基化检测引物探针体系，其特征在于：所述报告荧光基团为fam或vic。

4.根据权利要求1所述的septin9基因甲基化检测引物探针体系，其特征在于：septin9基因甲基化的概率=报告探针a所带荧光的拷贝数÷（报告探针a所带荧光的拷贝数+报告探针a’所带荧光的拷贝数）。

5.一种含有如权利要求1-4任一项所述的引物探针体系的septin9基因甲基化检测试剂盒。