一种生产糖苷水解酶的工程菌及其制备方法和应用

本发明属于生物，涉及一种生产糖苷水解酶的工程菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、糖苷水解酶是水解两个糖分子或糖分子与非糖分子之间糖苷键的一类酶，另外，有些糖苷水解酶具有转糖苷作用，用于合成寡糖和苷类物质，如槐糖、低聚半乳糖等。糖苷水解酶生物和化学产业，如食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域有广泛的应用。酶的高效表达是实现其产业化应用的重要前提。枯草芽孢杆菌具有生物安全性好、培养简单、表达效率高、蛋白分泌到胞外等特点，在异源蛋白的表达中得到了广泛应用。但不同的蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量差异巨大，需要针对不同的蛋白筛选不同的启动子、信号肽等不同的基因元件，以及发酵条件的优化等才可能达到理想的表达效果。另一方面，简便、高效的酶应用和催化工艺也是实现其产业化应用的关键。

2、cn106282142b公开了一种β-甘露糖苷水解酶含量低的α-半乳糖苷水解酶的制备方法，采用里氏木霉以半乳甘露低聚糖为碳源和诱导物发酵产α-半乳糖苷水解酶，在获得较高α-半乳糖苷水解酶酶活力的同时，酶液中β-甘露糖苷水解酶含量(活力)很低，该酶液无需纯化除去β-甘露糖苷水解酶即可直接与β-甘露聚糖酶协同水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，可有效降低半乳甘露聚糖定向降解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的生产成本，但是不能利用发酵液进行直接催化。

3、因此，亟需提供一种高效表达糖苷水解酶以及利用糖苷水解酶发酵液直接催化糖苷反应的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种生产糖苷水解酶的工程菌及其制备方法和应用，目的是针对大肠杆菌对糖苷水解酶表达效率差，并且在胞内表达需要破壁等复杂的提取过程，提供一种枯草芽孢杆菌胞外高效分泌糖苷水解酶的方法以及富含糖苷水解酶的发酵液直接应用于催化糖苷反应的方法。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种生产糖苷水解酶的工程菌，所述工程菌分泌糖苷水解酶需要信号肽的引导；

4、所述信号肽包括tat途径信号肽spphod、tat途径信号肽splipa或tat途径信号肽spalbb中至少一种。

5、本发明设计全新的策略，构建生产糖苷水解酶的工程菌，利用特定的信号肽，能够显著提高糖苷水解酶的胞外产量。

6、优选地，所述tat途径信号肽spphod的氨基酸序列包括如seq id no:1所示的序列。

7、优选地，所述tat途径信号肽splipa的氨基酸序列包括如seq id no:2所示的序列。

8、优选地，所述tat途径信号肽spalbb的氨基酸序列包括如seq id no:3所示的序列。

9、优选地，所述糖苷水解酶的氨基酸序列包括如seq id no:4所示的序列。

10、可以理解，seq id no:4所示的序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质均适用于本发明。

11、seq id no:1：

12、maydsrfdewvqklkeesfqnntfdrrkfiqgagkiaglslgltiaqsvga。

13、seq id no:2：

14、mkfvkrriialvtilmlsvtslfalqpsakaa。

15、seq id no:3：

16、mlspaqrrillyilsfifvigavvyfvksdylftlifiaiaile。

17、seq id no:4：

18、msfpkgflwgaatasyqiegawnedgkgesiwdrfthqkgnilyghngdvacdhyhrheedvslmkelgikayrfstawarifpdgfgninqkglefydklinelvengiepvvtlyhwdlpqklqdiggwanpeivnyyfeyamliinrykdkvkkwitfnepyciaflghwhgihapgiknfkvamdvvhnimlshfkvvkavkennidveigitlnltpvylqterlgykvseieremvnlssqldnelfldpvlkgsypqklldylvqkdll dsqkvnnmqqevkenfifpdflginyytrsvrlydensgwifpirwehpageytemgwevfpqglfdlliwikesypqipiyitengaayndkvedgrvhdqkrveylkqhfeaarkaikngvdlrgyfvwslidnfewamgytkrfgiiyvdyetqkrikkdsfyfyqqyikens。

19、优选地，启动所述糖苷水解酶表达的启动子包括phpaii、pspovg或psacb。

20、优选地，所述phpaii的核酸序列包括如seq id no:5所示的序列。

21、优选地，所述pspovg的核酸序列包括如seq id no:6所示的序列。

22、优选地，所述psacb的核酸序列包括如seq id no:7所示的序列。

23、本发明中，利用特定的启动子，能够进一步提高糖苷水解酶产量。

24、seq id no:5：

25、tactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgacagcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgatttaca。

26、seq id no:6：

27、tgcggaagtaaacgaagtgtacggacaatattttgacactcacaaaccggcgagatcttgtgttgaagtcgcgagactcccgaaggatgcgttagtcgagatcgaagttattgcactggtgaaataataagaaaagtgattctgggagagccgggatcacttttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttatatagg。

28、seq id no:7：

29、cccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactttatgcccatgcaacagaaactataaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttaggcccgtagtctgcaaatccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgcaatccaaacgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacg。

30、优选地，所述基因工程菌还缺失蛋白酶基因npre和/或和apre。

31、本发明中，再敲除蛋白酶基因npre和/或apre，能够进一步提高糖苷水解酶产量。

32、优选地，所述生产糖苷水解酶的工程菌的出发菌株为枯草芽孢杆菌。

33、优选地，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌b.subtilis168。

34、第二方面，本发明提供了第一方面所述的生产糖苷水解酶的工程菌的制备方法，所述制备方法包括：

35、将所述信号肽的编码核酸和所述糖苷水解酶的编码核酸融合连接，并插入表达载体，获得重组载体，将所述重组载体导入出发菌株，得到所述生产糖苷水解酶的工程菌，或，

36、将所述信号肽的编码核酸和所述糖苷水解酶的编码核酸融合连接，插入出发菌株的基因组中，得到所述生产糖苷水解酶的工程菌。

37、优选地，所述制备方法还包括设置所述信号肽的编码核酸和所述糖苷水解酶的编码核酸的启动子为phpaii、pspovg或psacb。

38、优选地，所述制备方法还包括敲除出发菌株中的蛋白酶基因npre和/或apre。

39、第三方面，本发明提供了第一方面所述的生产糖苷水解酶的工程菌在制备糖苷水解酶中的应用。

40、第四方面，本发明提供了一种制备糖苷水解酶的方法，所述制备糖苷水解酶的方法包括：

41、发酵培养第一方面所述的生产糖苷水解酶的工程菌，发酵后，收集去除菌体的培养液，获得所述糖苷水解酶。

42、优选地，所述发酵培养的培养基含有葡萄糖5-40g/l、胰蛋白胨1-12g/l、酵母浸粉2-20g/l、nacl 1-12g/l、na2hpo4·12h2o 1.0-9.2g/l、k2hpo4 1.0-6.8g和mgso4·7h2o0.2-3.0g/l。

43、本发明中，成功筛选出适合糖苷酸水解酶表达的培养基，在该培养基中表达β-葡萄糖苷酶活为150.853u/ml，是工程菌在lb培养基中表达酶活4.174u/ml的36.14倍。

44、优选地，所述发酵培养包括：将培养12-24h的工程菌种子液接入盛有灭过菌的发酵培养基的发酵罐中进行补料发酵，发酵后离心发酵液得到上清液，即为糖苷水解酶溶液。

45、优选地，所述补料发酵的温度为25-40℃。

46、优选地，所述发酵培养基的ph 4.0-6.5。

47、优选地，所述补料发酵的溶氧5-50％。

48、优选地，所述补料发酵的补料速率为0.1-6.2g葡萄糖/l-1h-1。

49、优选地，所述补料发酵的时间为36-120h。

50、本发明中，还可进行发酵放大培养，具体地，将工程菌置于发酵罐中培养，β-葡萄糖苷酶活达到200-4000u/ml，是摇瓶发酵酶活的1.3-26.5倍。

51、第五方面，本发明提供第四方面所述的制备糖苷水解酶的方法制备的糖苷水解酶在催化糖苷水解和/或糖基转移中的应用。

52、优选地，由于酶液中的盐离子浓度对酶的催化效率有影响，调整发酵培养的培养基中无机盐浓度：nacl 1-6g/l、na2hpo4·12h2o 1.0-6.4g/l、k2hpo4 1.0-4.4g和mgso4·7h2o 0.2-0.6g/l，可提高第四方面所制备糖苷水解酶的催化效率。

53、应当理解的是，本发明所述的糖苷水解酶可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的糖苷水解酶制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

54、第六方面，本发明提供一种制备槐糖的方法，所述制备槐糖的方法包括：取第五方面所述的糖苷水解酶，催化葡萄糖制备槐糖。

55、优选地，所述方法具体包括：用ph为3.5-5.5的缓冲液稀释糖苷水解酶溶液至β-葡萄糖苷酶活为50-150u/ml，调ph至4.2-6.1，加入葡萄糖，至葡萄糖浓度为500-950g/l，于72-95℃反应2-12h，100-110℃保持5-15min将酶灭活，得到槐糖溶液。

56、本发明探究制备的糖苷水解酶的酶活性质，并将其应用于槐糖的合成，结果表明重组酶的最适ph值为5.5，最适反应温度为80℃，热稳定性良好；当酶浓度为95u/ml，糖浓度750g/l，反应时间6h时，槐糖产量为41.658g/l，而槐糖在极低的浓度(0.34ppm)时就对里氏木霉生产纤维素酶有诱导作用，因此，本发明中合成的槐糖浓度足以诱导里氏木霉生产纤维素酶，为槐糖应用于诱导氏木霉产纤维素酶的工业化生产奠定基础。

57、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

58、本发明以来源于caldicellulosiruptor owensensis的糖苷水解酶cogh1a为研究对象，利用特定的启动子和信号肽在枯草芽孢杆菌中进行外源表达，同时敲除npre和/或apre基因，实现糖苷水解酶的高效胞外生产，在lb培养基发酵表达酶活为4.174u/ml，并对工程菌进行培养基筛选，成功筛选出适合糖苷水解酶表达的fb培养基，在fb培养基中表达酶活为150.853u/ml，是工程菌在lb培养基中表达酶活4.174u/ml的36.14倍，此外，探究糖苷水解酶的酶活性质，并将糖苷水解酶应用于槐糖的合成，结果表明糖苷水解酶的最适ph值为5.5，最适反应温度为80℃，热稳定性良好；当酶浓度为95u/ml，糖浓度750g/l，反应时间6h时，槐糖产量为41.658g/l，实现槐糖的低成本生产，使其可以作为诱导物用于纤维素酶的工业化生产，也为其它异源蛋白的高效表达提供表达载体构建方法和生产方法。