5βR突变体和7βH突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的用途的制作方法
技术特征：
1.一种5β还原酶突变体，其中，突变是在野生型5β还原酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型5β还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型5β还原酶相比，所述5β还原酶突变体的酶活性提高；
2.根据权利要求1所述5β还原酶突变体，其中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：
3.根据权利要求1或2所述的5β还原酶突变体，其中，所述5β还原酶突变体在如seq idno.6所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：
4.根据权利要求3所述的5β还原酶突变体，其中，所述5β还原酶突变体在如seq idno.6所示的氨基酸序列中包含g151n取代。
5.根据权利要求4所述的5β还原酶突变体，其中，所述5β还原酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：
6.根据权利要求5所述的5β还原酶突变体，其中，所述5β还原酶突变体在如seq idno.6所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：
7.核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-6任一项所述的5β还原酶突变体。
8.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求7所述的核酸。
9.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的表达载体；
10.一种7β羟化酶突变体，其中，突变是在野生型7β羟化酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型7β羟化酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型7β羟化酶相比，所述7β羟化酶突变体的酶活性提高；
11.根据权利要求10所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体在如seq idno.8所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：
12.根据权利要求10或11所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体在如seqid no.8所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：
13.根据权利要求12所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体在如seq idno.8所示的氨基酸序列中包含v239l取代。
14.根据权利要求13所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：
15.根据权利要求14所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体还包含以下位置的取代：f143s+s171g+d190v+s271a。
16.根据权利要求14所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体在如seq idno.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：v239l+f143s+s171g+d190v+s271a，其氨基酸序列如seq id no.100所示。
17.根据权利要求16所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：
18.根据权利要求17所述的7β羟化酶突变体，其中，所述7β羟化酶突变体在如seq idno.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：
19.核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求10-18任一项所述的7β羟化酶突变体。
20.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求19所述的核酸。
21.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求19所述的核酸或权利要求20所述的表达载体。
22.一种熊脱氧胆酸的制备方法，所述方法通过工程化分枝杆菌菌株生产熊脱氧胆酸，所述工程化分枝杆菌菌株含有编码野生型5β-还原酶或其突变体、3α-羟基类固醇脱氢酶，和/或野生型7β羟化酶或其突变体的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述步骤a)前还包含以下步骤：
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.126所示，核苷酸序列如seq id no.125所示。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述野生型5β还原酶的氨基酸序列包含与如seq id no.6所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列，所述5β还原酶突变体是在野生型5β还原酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型5β还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型5β还原酶相比，所述5β还原酶突变体的酶活性提高。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：
27.根据权利要求22-26任一项所述的方法，其中，所述野生型7β羟化酶的氨基酸序列包含与如seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列，所述7β羟化酶突变体是在野生型7β羟化酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型7β羟化酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型7β羟化酶相比，所述7β羟化酶突变体的酶活性提高。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：
29.权利要求1-5任一项所述的5β还原酶突变体、权利要求10-18任一项所述的7β羟化酶突变体、权利要求6或19所述的核酸、权利要求7或20所述的表达载体、权利要求9或21所述的宿主细胞在制备熊脱氧胆酸中的应用。
技术总结
本发明属于生物酶工程领域，具体涉及一种5βR突变体和7βH突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的用途。具体地，本公开提供了一种5β还原酶突变体，其中，突变是在5β还原酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在5β还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与5β还原酶相比，所述5β还原酶突变体的酶活性提高；所述5β还原酶包含与如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列。5βR突变体和7βH突变体同时存在时，能帮助提高工程化的新金色分枝杆菌的UDCA产量，同野生型菌株相比，产量可提升14倍。
技术研发人员：华伦·刘,江丽红,张志雨
受保护的技术使用者：杭州恩和生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/11/26
技术研发人员：华伦·刘,江丽红,张志雨
技术所有人：杭州恩和生物科技有限公司
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