5βR突变体和7βH突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的用途的制作方法

本发明属于生物酶工程领域，具体涉及一种5βr突变体和7βh突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的用途。

背景技术：

1、熊脱氧胆酸(udca)是一种用于治疗胆汁淤积性肝病的药物。它的作用机制包括促进胆汁分泌、抑制疏水性胆酸的细胞毒作用、保护肝细胞和胆管细胞、改善胆汁淤积、降低碱性磷酸酶(alp)、γ-谷氨酰转肽酶(ggt)、免疫球蛋白m(igm)水平等。目前熊脱氧胆酸的生产方法主要依赖于刺激性化学品和溶剂以及动物源性原料(胆酸)。由于与潜在致病性污染相关的安全问题，这种方法并不受欢迎。生物合成或生物转化是一种潜在的替代方法，它可能更具成本效益，化学废物更少，并且不依赖于动物源性底物。

2、一种可能的非天然途径是通过工程分枝杆菌菌株将植物甾醇直接转化为udca。4-胆烯酸-3-酮(4ca3o)作为关键途径中间体，随后通过三个异源酶催化步骤转化：1)5β-还原酶(5βr)将4ca3o还原为3-酮-石胆酸(3-keto-lca)，2)3α-羟基类固醇脱氢酶(3αhsd)还原3-keto-lca的3-酮位置形成石胆酸(lca)，3)7β-羟化酶(7βh)催化lca的7β-羟基化产生udca。

3、虽然已鉴定出用于每个异源步骤的天然酶，但现有技术中的5βrs和7βhs往往存在活性低的缺陷。因此，开发具有更高活性的5βr和7βh非常重要，以便实现植物甾醇到udca转化或相关过程的经济有效性。例如，改进的7βh突变体可用于通过生物转化或生物催化(体外)过程将lca转化为udca。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种5βr和7βh突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的用途。

2、为了解决以上技术问题，本公开采用以下技术方案：

3、一方面，本公开提供了一种5β还原酶突变体，其中，突变是在野生型5β还原酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型5β还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型5β还原酶相比，所述5β还原酶突变体的酶活性提高；

4、所述野生型5β还原酶包含与如seq id no.6所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列。

5、在一些实施方案中，所述野生型5β还原酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。

6、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：

7、i37、l127、g151、f153、t154、p163、m214、k282、f342、a343或v345。

8、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：

9、(1)i37n；

10、(2)l127l；

11、(3)g151n，g151w，g151q或g151i中任一取代；

12、(4)f153s或f153t；

13、(5)t154m或t154r；

14、(6)p163k；

15、(7)m214t；

16、(8)k282s；

17、(9)f342a，f342t，f342n或f342r中任一取代；

18、(10)a343h；或

19、(11)v345k。

20、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列中包含g151n取代。在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.10所示。

21、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体还具有选自以下任一组位置的取代：

22、(1)i37n+f153s+k282s+f342a+v345k；

23、(2)f153t+t154r+k282s+v345k；

24、(3)t154r+k282s+f342t+v345k；

25、(4)n151w+t154m+k282s+f342t+v345k；

26、(5)l127l+f153t+t154r+k282s+v345k；

27、(6)l127l+n151w+t154r+k282s+v345k；

28、(7)f153t+v345k；

29、(8)l127l+v345k；

30、(9)i37n+f153t+t154r+k282s+f342a+v345k；

31、(10)l127l+n151w+f153t+t154m+k282s+f342a+v345k；

32、(11)l127l+f153s+t154r+f342a+v345k；

33、(12)i37n+l127l+f153s+t154r+k282s+v345k；

34、(13)l127l+f153s+t154m+k282s+v345k；

35、(14)l127l+f153s+f342t+v345k；

36、(15)n151w+f153t+t154r+f342a+v345k；

37、(16)f153t+t154r+k282s+f342a；

38、(17)n151w+f153t+t154m+f342a+v345k；或

39、(18)t154r+k282s+v345k。

40、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体还具有选自以下任一组位置的取代：

41、(1)i37n+f153s+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.44所示；

42、(2)f153t+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.46所示；

43、(3)t154r+k282s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.48所示；

44、(4)n151w+t154m+k282s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.50所示；

45、(5)l127l+f153t+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.52所示；

46、(6)l127l+n151w+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.54所示；

47、(7)f153t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.56所示；

48、(8)l127l+v345k，其氨基酸序列如seq id no.58所示；

49、(9)i37n+f153t+t154r+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.60所示；

50、(10)l127l+n151w+f153t+t154m+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq idno.62所示；

51、(11)l127l+f153s+t154r+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.64所示；

52、(12)i37n+l127l+f153s+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.66所示；

53、(13)l127l+f153s+t154m+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.68所示；

54、(14)l127l+f153s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.70所示；

55、(15)n151w+f153t+t154r+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.72所示；

56、(16)f153t+t154r+k282s+f342a，其氨基酸序列如seq id no.74所示；

57、(17)n151w+f153t+t154m+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.76所示；或

58、(18)t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.78所示。

59、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：

60、(1)g151n+l127l+f153s+t154r+f342a+v345k，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.64所示；或

61、(2)g151n+l127l+f153s+f342t+v345k，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seqid no.70所示。

62、另一方面，本公开提供了核酸，所述核酸编码前述的5β还原酶突变体。

63、另一方面，本公开提供了表达载体，所述表达载体包含前述的核酸。

64、另一方面，本公开提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的核酸或前述的表达载体。

65、在一些实施方案中，所述宿主细胞为工程化分枝杆菌。在一些实施方案中，所述工程化分枝杆菌为能够将植物甾醇转化为4ca3o的mycobacterium neoaurum菌株(参见pct公开号：wo2024131933)。

66、在一些实施方案，所述工程化分枝杆菌中还表达另一种酶突变体。在一些实施方案中，所述工程化分枝杆菌还表达7β还原酶突变体。

67、另一方面，本公开提供了一种制备5β还原酶突变体的方法，所述方法通过表达编码前述的5β还原酶突变体的核酸来生产制备5β还原酶突变体。

68、另一方面，本公开提供了一种7β羟化酶突变体，其中，突变是在野生型7β羟化酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型7β羟化酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型7β羟化酶相比，所述7β羟化酶突变体的酶活性提高；所述野生型7β羟化酶包含与如seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列。

69、在一些实施方案中，所述野生型7β羟化酶的氨基酸序列如seq id no.8所示。

70、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：

71、a10、t37、m41、h54、v59、l61、p77、h142、f143、s171、y180、r186、a188、d190、l193、v239、q248、s258、e264、a268、p270、s271、a288、s289、v300、f314、a371、g375、t389或m391。

72、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：

73、(1)a10d；

74、(2)t37t；

75、(3)m41a；

76、(4)h54h；

77、(5)v59k；

78、(6)l61l；

79、(7)p77p；

80、(8)h142s；

81、(9)f143q，f143s或f143l中任一取代；

82、(10)s171g；

83、(11)y180a；

84、(12)r186c或r186s中任一取代；

85、(13)a188a；

86、(14)d190v；

87、(15)l193t；

88、(16)v239l；

89、(17)q248a；

90、(18)s258i；

91、(19)e264i；

92、(20)a268v；

93、(21)p270a；

94、(22)s271a；

95、(23)a288l；

96、(24)s289v；

97、(25)v300l；

98、(26)f314l；

99、(27)a371s；

100、(28)g375s；

101、(29)t389m；或

102、(30)m391n或m391a中任一取代。

103、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列中存在v239l取代。在一些实施方案中，所述野生型7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq idno.80所示。

104、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

105、(1)f143s+s171g+d190v+s271a；

106、(2)p77p+f143q+r186c+e264i+t389m；

107、(3)f143s+s171g+p270a+s289v+g375s；

108、(4)f143s+s171g+l193t+p270a+f314l；

109、(5)f143q+s171g+a188a+p270a+s271a+f314l；

110、(6)t37t+v59k+h142s+f143l+r186s+v300l；或

111、(7)h142s+f143l+r186s+e264i+a268v。

112、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

113、(1)f143s+s171g+d190v+s271a，其氨基酸序列如seq id no.100所示；

114、(2)p77p+f143q+r186c+e264i+t389m，其氨基酸序列如seq id no.102所示；

115、(3)f143s+s171g+p270a+s289v+g375s，其氨基酸序列如seq id no.104所示；

116、(4)f143s+s171g+l193t+p270a+f314l，其氨基酸序列如seq id no.106所示；

117、(5)f143q+s171g+a188a+p270a+s271a+f314l，其氨基酸序列如seq id no.108所示；

118、(6)t37t+v59k+h142s+f143l+r186s+v300l，其氨基酸序列如seq id no.110所示；或

119、(7)h142s+f143l+r186s+e264i+a268v，其氨基酸序列如seq id no.112所示。

120、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含以下位置的取代：f143s+s171g+d190v+s271a。

121、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：v239l+f143s+s171g+d190v+s271a，其氨基酸序列如seq idno.100所示。

122、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

123、(1)v59k+s143q+e264i+a268v；

124、(2)r186c+e264i；

125、(3)l61l+r186s+a371s；

126、(4)p77p+r186c+s258i+a371s+t389m；或

127、(4)a10d+h54h+p77p+r186s+s289v+a371s。

128、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

129、(1)v59k+s143q+e264i+a268v，其氨基酸序列如seq id no.114所示；

130、(2)r186c+e264i，其氨基酸序列如seq id no.116所示；

131、(3)l61l+r186s+a371s，其氨基酸序列如seq id no.118所示；

132、(4)p77p+r186c+s258i+a371s+t389m，其氨基酸序列如seq id no.120所示；或

133、(4)a10d+h54h+p77p+r186s+s289v+a371s，其氨基酸序列如seq id no.122所示。

134、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：

135、(1)v239l+f143s+s171g+d190v+s271a+l61l+r186s+a371s，所述7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.118所示；或

136、(2)v239l+f143s+s171g+d190v+s271a+v59k+s143q+e264i+a268v，所述7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.114所示。

137、另一方面，本公开提供了核酸，所述核酸编码前述的7β羟化酶突变体。

138、另一方面，本公开提供了表达载体，所述表达载体包含前述的核酸。

139、另一方面，本公开提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的核酸或前述的表达载体。

140、另一方面，本公开提供了一种制备7β羟化酶突变体的方法，所述方法通过表达编码前述的7β羟化酶突变体的核酸来生产制备7β羟化酶突变体。

141、另一方面，本公开提供了一种熊脱氧胆酸的制备方法，所述方法通过工程化分枝杆菌菌株生产熊脱氧胆酸，所述工程化分枝杆菌菌株含有编码野生型5β-还原酶或其突变体、3α-羟基类固醇脱氢酶，和/或野生型7β羟化酶或其突变体的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：

142、a)通过野生型5β-还原酶或其突变体，将4-胆烯酸-3-酮还原为3-酮-石胆酸；

143、b)利用3α-羟基类固醇脱氢酶还原3-酮-石胆酸形成石胆酸；以及

144、c)通过野生型7β羟化酶或其突变体催化石胆酸形成熊脱氧胆酸。

145、在一些实施方案中，所述步骤a)前还包含以下步骤：

146、利用工程化分枝杆菌菌株的自然酶将底物转化为4-胆烯酸-3-酮。

147、在一些实施方案中，所述底物为植物甾醇、胆固醇；

148、在一些实施方案中，所述植物甾醇为β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油固醇、菜油甾烷醇、豆固醇或芸苔固醇。

149、在一些实施方案中，所述工程化分枝杆菌为mycobacterium neoaurum菌株(参见pct公开号：wo2024131933)。

150、在一些实施方案中，所述3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.126所示，核苷酸序列如seq id no.125所示。

151、在一些实施方案中，所述野生型5β还原酶的氨基酸序列包含与如seq id no.6所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列，所述5β还原酶突变体是在野生型5β还原酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型5β还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型5β还原酶相比，所述5β还原酶突变体的酶活性提高。

152、在一些实施方案中，所述野生型5β还原酶的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：

153、i37、l127、g151、f153、t154、p163、m214、k282、f342、a343或v345。

154、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：

155、(1)i37n；

156、(2)l127l；

157、(3)g151n，g151w，g151q或g151i中任一取代；

158、(4)f153s或f153t；

159、(5)t154m或t154r；

160、(6)p163k；

161、(7)m214t；

162、(8)k282s；

163、(9)f342a，f342t，f342n或f342r中任一取代；

164、(10)a343h；或

165、(11)v345k。

166、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列中包含g151n取代。在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.10所示。

167、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

168、(1)i37n+f153s+k282s+f342a+v345k；

169、(2)f153t+t154r+k282s+v345k；

170、(3)t154r+k282s+f342t+v345k；

171、(4)n151w+t154m+k282s+f342t+v345k；

172、(5)l127l+f153t+t154r+k282s+v345k；

173、(6)l127l+n151w+t154r+k282s+v345k；

174、(7)f153t+v345k；

175、(8)l127l+v345k；

176、(9)i37n+f153t+t154r+k282s+f342a+v345k；

177、(10)l127l+n151w+f153t+t154m+k282s+f342a+v345k；

178、(11)l127l+f153s+t154r+f342a+v345k；

179、(12)i37n+l127l+f153s+t154r+k282s+v345k；

180、(13)l127l+f153s+t154m+k282s+v345k；

181、(14)l127l+f153s+f342t+v345k；

182、(15)n151w+f153t+t154r+f342a+v345k；

183、(16)f153t+t154r+k282s+f342a；

184、(17)n151w+f153t+t154m+f342a+v345k；或

185、(18)t154r+k282s+v345k。

186、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

187、(1)i37n+f153s+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.44所示；

188、(2)f153t+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.46所示；

189、(3)t154r+k282s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.48所示；

190、(4)n151w+t154m+k282s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.50所示；

191、(5)l127l+f153t+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.52所示；

192、(6)l127l+n151w+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.54所示；

193、(7)f153t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.56所示；

194、(8)l127l+v345k，其氨基酸序列如seq id no.58所示；

195、(9)i37n+f153t+t154r+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.60所示；

196、(10)l127l+n151w+f153t+t154m+k282s+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq idno.62所示；

197、(11)l127l+f153s+t154r+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.64所示；

198、(12)i37n+l127l+f153s+t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.66所示；

199、(13)l127l+f153s+t154m+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.68所示；

200、(14)l127l+f153s+f342t+v345k，其氨基酸序列如seq id no.70所示；

201、(15)n151w+f153t+t154r+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.72所示；

202、(16)f153t+t154r+k282s+f342a，其氨基酸序列如seq id no.74所示；

203、(17)n151w+f153t+t154m+f342a+v345k，其氨基酸序列如seq id no.76所示；或

204、(18)t154r+k282s+v345k，其氨基酸序列如seq id no.78所示。

205、在一些实施方案中，所述5β还原酶突变体在如seq id no.6所示的氨基酸序列的以下位置存在以下取代：

206、(1)g151n+l127l+f153s+t154r+f342a+v345k，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.64所示；或

207、(2)g151n+l127l+f153s+f342t+v345k，所述5β还原酶突变体的氨基酸序列如seqid no.70所示。

208、在一些实施方案中，所述野生型7β羟化酶的氨基酸序列包含与如seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上同一性的氨基酸序列，所述7β羟化酶突变体是在野生型7β羟化酶的氨基酸序列中插入、取代或缺失1个或多个氨基酸，或者在野生型7β羟化酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，与野生型7β羟化酶相比，所述7β羟化酶突变体的酶活性提高。

209、在一些实施方案中，所述野生型7β羟化酶的氨基酸序列如seq id no.8所示，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含一个或多个取代：

210、a10、t37、m41、h54、v59、l61、p77、h142、f143、s171、y180、r186、a188、d190、l193、v239、q248、s258、e264、a268、p270、s271、a288、s289、v300、f314、a371、g375、t389或m391。

211、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下一个或多个位置包含一个或多个取代：

212、(1)a10d；

213、(2)t37t；

214、(3)m41a；

215、(4)h54h；

216、(5)v59k；

217、(6)l61l；

218、(7)p77p；

219、(8)h142s；

220、(9)f143q，f143s或f143l中任一取代；

221、(10)s171g；

222、(11)y180a；

223、(12)r186c或r186s中任一取代；

224、(13)a188a；

225、(14)d190v；

226、(15)l193t；

227、(16)v239l；

228、(17)q248a；

229、(18)s258i；

230、(19)e264i；

231、(20)a268v；

232、(21)p270a；

233、(22)s271a；

234、(23)a288l；

235、(24)s289v；

236、(25)v300l；

237、(26)f314l；

238、(27)a371s；

239、(28)g375s；

240、(29)t389m；或

241、(30)m391n或m391a中任一取代。

242、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列中包含v239l取代。在一些实施方案中，所述野生型7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq idno.80所示。

243、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

244、(1)f143s+s171g+d190v+s271a；

245、(2)p77p+f143q+r186c+e264i+t389m；

246、(3)f143s+s171g+p270a+s289v+g375s；

247、(4)f143s+s171g+l193t+p270a+f314l；

248、(5)f143q+s171g+a188a+p270a+s271a+f314l；

249、(6)t37t+v59k+h142s+f143l+r186s+v300l；或

250、(7)h142s+f143l+r186s+e264i+a268v。

251、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

252、(1)f143s+s171g+d190v+s271a，其氨基酸序列如seq id no.100所示；

253、(2)p77p+f143q+r186c+e264i+t389m，其氨基酸序列如seq id no.102所示；

254、(3)f143s+s171g+p270a+s289v+g375s，其氨基酸序列如seq id no.104所示；

255、(4)f143s+s171g+l193t+p270a+f314l，其氨基酸序列如seq id no.106所示；

256、(5)f143q+s171g+a188a+p270a+s271a+f314l，其氨基酸序列如seq id no.108所示；

257、(6)t37t+v59k+h142s+f143l+r186s+v300l，其氨基酸序列如seq id no.110所示；或

258、(7)h142s+f143l+r186s+e264i+a268v，其氨基酸序列如seq id no.112所示。

259、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含以下位置的取代：f143s+s171g+d190v+s271a。

260、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：v239l+f143s+s171g+d190v+s271a，其氨基酸序列如seq idno.100所示。

261、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

262、(1)v59k+s143q+e264i+a268v；

263、(2)r186c+e264i；

264、(3)l61l+r186s+a371s；

265、(4)p77p+r186c+s258i+a371s+t389m；或

266、(4)a10d+h54h+p77p+r186s+s289v+a371s。

267、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体还包含选自以下任一组位置的取代：

268、(1)v59k+s143q+e264i+a268v，其氨基酸序列如seq id no.114所示；

269、(2)r186c+e264i，其氨基酸序列如seq id no.116所示；

270、(3)l61l+r186s+a371s，其氨基酸序列如seq id no.118所示；

271、(4)p77p+r186c+s258i+a371s+t389m，其氨基酸序列如seq id no.120所示；或

272、(4)a10d+h54h+p77p+r186s+s289v+a371s，其氨基酸序列如seq id no.122所示。

273、在一些实施方案中，所述7β羟化酶突变体在如seq id no.8所示的氨基酸序列的以下位置包含以下取代：

274、(1)v239l+f143s+s171g+d190v+s271a+l61l+r186s+a371s，所述7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.118所示；或

275、(2)v239l+f143s+s171g+d190v+s271a+v59k+s143q+e264i+a268v，所述7β羟化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.114所示。

276、在一些实施方案中，所述方法在25-35℃的温度下进行。

277、另一方面，本公开提供了一种前述的5β还原酶突变体、前述的7β羟化酶突变体、前述的核酸、前述的表达载体、前述的宿主细胞在制备熊脱氧胆酸中的应用。

278、本公开的有益效果至少如下：

279、本技术公开的5βr突变体和7βh突变体相较于亲本酶，其酶活性均得到提高，5βr突变体和7βh突变体同时存在时，能帮助提高工程化的新金色分枝杆菌的udca产量，同野生型菌株相比，产量可提升14倍。