一种5-酮基米尔贝霉素的产生菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物工程，具体涉及一种5-酮基米尔贝霉素高产的冰城链霉菌(streptomyces bingchengensis)及其在制备5-酮基米尔贝霉素中的应用。

背景技术：

1、米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，在国际上又被称为弥拜霉素，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年的改良于1986年正式以商品名米尔贝肟(milbemycinoxime)上市。米尔贝霉素对各种螨虫、农业害虫以及园艺害虫也有很好的防治效果，杀死靶标螨虫并对其形成长效的防治。另外，米尔贝霉素的杀螨活性也不易受温度的影响且作用机理不同于传统杀螨剂，对一些已产生抗性的害螨仍有很高的防效，因此被认为是当今世界上最优良的杀螨剂。米尔贝肟是米尔贝霉素a3和米尔贝霉素a4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果，具有广谱防治活性，活性高，用量小，对人畜安全，不污染环境，对天敌无害，不易产抗性。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。

2、米尔贝肟主要都是通过半合成的方法生产，首先，产米尔贝霉素的链霉菌经过发酵得到米尔贝霉素a3和a4；然后米尔贝霉素a3和a4的c-5羟基被氧化成酮，分别得到5-酮基米尔贝霉素的a3和a4(结构式如式1、式2所示)；再以盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。

3、

4、在已知的米尔贝霉素生物合成途径中，首先产生的是5-酮基米尔贝霉素，在milf基因编码的c5-酮还原酶催化作用下，将c-5酮基还原成羟基从而得到最终的发酵产物米尔贝霉素a3和a4。我公司通过基因工程技术敲除了milf基因，阻断了生物体内的c-5酮基还原反应，成功获得了能够直接发酵生产5-酮基米尔贝霉素的基因工程菌yz1-10，省去了氧化反应步骤，简化了米尔贝肟的合成工艺，并申报了相关专利zl201310541829.8。

5、我公司进一步对该基因工程菌yz1-10进罐验证效价时发现，发酵过程中产生大量气泡，泡沫顶罐增加染菌风险，需加入泡敌抑制，但发现泡敌对菌体产素影响很大，加入泡敌后高产素期增速放缓，总产量明显降低，不能满足工业化生产的需求。因此，亟需一种有效的方法来解决发酵过程中泡敌对基因工程菌yz1-10产素的影响。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种能够产生5-酮基米尔贝霉素的新的冰城链霉菌(streptomyces bingchengensis sp.)hs-5-oxo-mil-116，其保藏编号为cgmcc no.29877。

2、本发明所述的冰城链霉菌hs-5-oxo-mil-116的微生物菌种于2024年02月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc no.29877，分类名为冰城链霉菌(streptomyces bingchengensis sp.)，并登记在册，证明存活。

3、本发明的目的还在于提供了一种冰城链霉菌hs-5-oxo-mil-116在生产5-酮基米尔贝霉素或含有5-酮基米尔贝霉素的药物组合物中的应用。

4、本发明还提供一种培养5-酮基米尔贝霉素孢子生长的方法，利用上述的冰城链霉菌hs-5-oxo-mil-116在含有可同化的碳源和/或氮源、泡敌、琼脂的固体培养基进行耐受有氧生长。

5、在优选的实施方案中，所述固体培养基中可同化的碳源选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、d-半乳糖、糊精、可溶性淀粉、麦芽糖之一或者上述物质的组合，优选甘露醇。

6、在优选的实施方案中，所述固体培养基中可同化的氮源选自酵母抽提粉、麦芽抽提粉、黄豆饼粉、酶化水解酪蛋白、酸化水解酪蛋白、脱脂奶粉之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉。

7、在优选的实施方案中，所述固体培养基含有甘露醇10～50g/l、黄豆饼粉10～50g/l、琼脂10～30g/l、泡敌1～10g/l，消前ph7.0～7.2，优选地，所述固体培养基含有甘露醇20g/l，黄豆饼粉20g/l、琼脂20g/l，泡敌5g/l，消前ph 7.2。

8、在优选的实施方案中，所述有氧生长的温度为26～30℃，优选28℃；所述有氧生长的时间为7～10天，优选8天。

9、本发明进一步提供一种制备5-酮基米尔贝霉素的方法，利用上述的冰城链霉菌hs-5-oxo-mil-116在含有可同化的碳源和/或氮源、泡敌的营养培养基进行有氧发酵。

10、在优选的实施方案中，所述营养培养基中可同化的碳源选自可溶性淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油、果糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木聚糖、工业糖蜜之一或者上述物质的组合，优选蔗糖。

11、在优选的实施方案中，所述营养培养基中可同化的氮源选自黄豆饼粉、酵母膏、麦芽膏、脱脂奶粉、酵母抽提粉、酵母蛋白胨、花生饼粉、酵母粉、玉米浆干粉、麸质粉、小麦胚芽片、大豆蛋白胨、玉米粉、豆粕之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉、花生饼粉、麸质粉、或者玉米粉之一与酵母膏、麦芽膏的组合，进一步优选黄豆饼粉、酵母膏、麦芽膏的组合。

12、在优选的实施方案中，所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自硫酸锌、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钴、钼酸钠、柠檬酸三钠、碳酸钙、氯化钙之一或者上述物质的组合，优选硫酸亚铁、磷酸氢二钾、碳酸钙、硫酸镁的组合。

13、在优选的实施方案中，所述营养培养基含有蔗糖、黄豆饼粉、麦芽膏、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸钙、泡敌；优选地，所述营养培养基含有蔗糖100～500g/l、黄豆饼粉10～50g/l、麦芽膏1～10g/l、酵母膏1～10g/l、硫酸亚铁0.01～0.1g/l、磷酸氢二钾0.1～1g/l、硫酸镁0.1～1g/l、碳酸钙1～10g/l、泡敌1～10g/l；进一步优选地，所述营养培养基含有蔗糖160g/l、黄豆饼粉20g/l、麦芽膏5g/l、酵母膏5g/l、硫酸亚铁0.05g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙3.0g/l、泡敌2g/l。

14、在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为26～30℃，优选28℃；营养培养基的ph为6.0～8.0，优选6.8～7.2；有氧发酵的时间为240～400小时，优选264～312小时。

15、本发明所述的5-酮基米尔贝霉素指的是5-酮基米尔贝霉素a3与a4的总和，换句话说，本发明所测的5-酮基米尔贝霉素的效价为5-酮基米尔贝霉素a3与a4效价的总和。

16、本发明5-酮基米尔贝霉素通过以下条件进行hplc检测：

17、色谱柱：依利特ods2(4.6×150mm，5μm)

18、柱温：25℃；

19、进样体积：5μl；

20、流速：1ml/min；

21、检测波长：240nm；

22、分析时间：15min；

23、流动相：乙腈：水＝85：15(v/v)；

24、其中，5-酮基米尔贝a3峰的保留时间为6.0min左右；5-酮基米尔贝a4峰的保留时间为7.4min左右。

25、本发明泡敌耐受诱变菌株hs-5-oxo-mil-116(cgmcc no.29877)的主要生物学特征是：菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径大小约8～12mm，菌落表面有褶皱，有沟纹，中间凸起，基质菌丝发达，与培养基结合不紧密，易挑起，基质菌丝赭石棕色，气生菌丝玛瑙灰，产孢丰富，前期信号白，后期转米白色，无可溶性色素。

26、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

27、本发明hs-5-oxo-mil-116(cgmcc no.29877)为一株全新的5-酮基米尔贝霉素产生菌，其生产5-酮基米尔贝霉素的能力较现有技术中其他菌种有大幅度的提高，效价可高达6964mg/l，而zl201310541829.8公布的基因工程菌yz1-10，其产5-酮基米尔贝霉素的效价仅为3562mg/l，更有利于实现工业化生产。