制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法

本发明涉及制备人多能干细胞衍生的睾丸间质(leydig)样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法。本技术要求申请号为2022-021533的日本专利的优先权，该申请通过引用并入本文。

背景技术：

1、近年来，与年龄相关的男性性腺功能减退综合征(迟发性性腺功能减退症(loh)综合征)引起了人们的关注，该综合征是由与年龄相关的男性激素的下降引起的，并引发各种症状。为了解决这个问题，已经进行了睾酮的激素替代疗法。然而，激素替代疗法产生的激素值与生理分泌模式不同，且作用持续时间短，因此需要重复给药，给患者带来沉重负担。一直需要开发一种新的治疗方法，这种方法不需要重复给药，在就医时间、注射相关的工作及疼痛等方面得到了改善，并提高了生活质量(qol)。

2、下丘脑产生促性腺激素释放激素(gnrh)。作为对gnrh的产生的应答，垂体前叶产生黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)。据估计，睾丸中的睾丸间质细胞对lh的应答是每天产生5mg至10mg的睾酮。睾酮是由胆固醇通过几种中间化合物合成的，如脱氢表雄酮(dhea)和雄烯二酮。

3、有人试图开发使用具有自我复制性和多谱系潜能的多能干细胞诱导分化为各种细胞的方法。在多能干细胞中使用胚胎干细胞(es细胞)和诱导多能干细胞(ips细胞)的技术引起了人们的关注。已经进行了各种尝试，通过将作为转录因子的类固醇生成因子-1(sf-1)稳定地引入各种间充质干细胞中，并在培养基中添加环磷酸腺苷(camp)，诱导分化为睾丸和肾上腺的类固醇激素产生细胞。sf-1是细胞内转录因子核受体家族的成员，由核受体亚家族5中的a组成员1(nr5a1)基因编码。

4、已经报道了一种方法，其中将sf-1引入两种类型的人es细胞(h9株和khes1株)和一种类型的人ips细胞系(201b7株)，以诱导分化为类固醇激素产生细胞。在该方法中，通过使用6-溴靛玉红-3′-肟(bio)和糖原合酶激酶3(gsk-3)抑制剂，诱导每个人es细胞系和人ips细胞系分化为中胚层细胞，并用流式细胞术分选所述中胚层细胞。然后将sf-1引入含有pcmflag-hsnr5a1的质粒的中胚层细胞中，以表达sf-1，从而实现表达。所得细胞在含有8-溴-camp(8-br-camp)的培养基中进一步培养，并诱导分化为类固醇激素产生细胞。然而，该报告提及了孕酮和皮质醇的产生，但没有描述睾酮的产生，也没有公开作为睾丸间质细胞选择性标志的标记物(insl3、17βhsd3、lhcgr等)的表达(非专利文献1)。

5、另一种公开的方法中，小鼠多能干细胞(es细胞)被诱导分化为间充质干细胞，然后所述间充质干细胞在sf-1的条件下表达以分化为类固醇激素产生细胞(专利文献1)。然而，该发明没有报告睾酮和皮质醇等激素的产生，也没有示出作为睾丸间质细胞标志的标记物的表达。

6、一份报告描述了用慢病毒载体将小鼠sf-1引入小鼠es细胞(oricellstrainc57bl/6mesc)以产生sf-1+esc菌株(esc-sf-1)，然后在含有8-br-camp和毛喉素的培养基中进一步培养，并诱导其分化为睾丸间质祖细胞(plc)。该描述表明，用8-br-camp和毛喉素处理esc-sf-1比仅用8-br-camp处理更有效地诱导plc分化。在该报告中，将由此获得的plc作为睾丸间质样细胞移植到大鼠体内，然后从血清样本等中测量作为睾丸间质细胞标志的标记物等(非专利文献2)。

7、一项公开提供了一种方法，其中nr5a1在人多能干细胞中表达，以产生表达insl3并且还表达选自17βhsd3和lhcgr的至少一种标记物的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞(专利文献2)。此外，另一项公开示出了一种产生表达hsd17b3、insl3、lhcgr等的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法(非专利文献3)。然而，需要制备能够更稳定地持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。

8、引文列表

9、非专利文献

10、[npl 1]endocrinology,153(9):4336-4345(2012)

11、[npl 2]stem cells and development,24(4):459-470(2015)

12、[npl 3]endocrinology,2021,vol.162,no.12,1-11,https://doi.org/10.1210/endocr/bqab202

13、专利文献

14、[ptl 1]jp 2011-15630a

15、[ptl 2]wo 2018/088240a1(jp 6979702 b2)

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目的是提供一种制备能够稳定和持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，以及一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。本发明的另一目的是提供一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其能够长期维持分泌足够量睾酮的睾丸间质样细胞，并提高分化诱导的效率。

3、问题解决方案

4、为了实现上述目的，本发明的发明人进行了认真的研究，并因此发现，通过制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，可以提供能够稳定和持久分泌睾酮的睾丸间质样细胞，所述方法包括在添加细胞因子混合物并强制表达nr5a1的培养条件下培养人多能干细胞的步骤，其中对用于添加或去除camp的时间、悬浮培养、贴壁培养等进行了各种方式的设计。因此，发明人实现了本发明。

5、也就是说，本发明包括以下内容。

6、1.一种制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，包括在人多能干细胞中强制表达nr5a1的步骤，其中所述方法包括向人多能干细胞的培养系统中添加选自wnt经典途径激活剂、骨形态发生蛋白4(bmp4)和血管内皮生长因子(vegf)中的一种或多种的步骤。

7、2.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自wnt经典途径激活剂、bmp4和vegf中的一种或多种的情况下，在人多能干细胞中强制表达nr5a1，然后悬浮培养2天至10天，随后进行贴壁培养的步骤。

8、3.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自wnt经典途径激活剂、bmp4和vegf中的一种或多种的情况下，在人多能干细胞中强制表达nr5a1，然后进行悬浮培养，直到所述人多能干细胞开始形成胚叶体，随后进行贴壁培养的步骤。

9、4.根据上述第2或3项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的wnt经典途径激活剂、bmp4和vegf，然后加入camp的步骤。

10、5.根据上述第4项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在开始用camp处理后的第2天至第40天期间从培养系统中去除camp的步骤。

11、6.根据上述第4项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的wnt经典途径激活剂、bmp4和vegf，然后用毛喉素处理的步骤。

12、7.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述在存在选自wnt经典途径激活剂、bmp4和vegf的一种或多种的情况下，人多能干细胞中强制表达nr5a1的步骤在能够形成50个细胞到20000个细胞的一个胚状体的培养装置上进行。

13、8.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述人多能干细胞中强制表达nr5a1的步骤包括在四环素依赖性基因表达系统中使用tet-off(商标名)系统，所述tet-off系统在不存在四环素或多西环素的情况下强制表达nr5a1。

14、9.根据上述第2项或第3项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在进行悬浮培养和贴壁培养之后进一步进行悬浮培养的步骤。

15、10.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中，从所述人多能干细胞到所述人多能干细胞衍生的睾丸间质状细胞的分化诱导效率为80％或更高。

16、11.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其通过上述第1项的方法制备。

17、12.根据上述第11项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞是连续产生睾酮至少60天的睾丸间质样细胞。

18、13.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其是在上述第11项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞传代至少一次后获得的。

19、14.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，包括上述第11项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。

20、15.根据上述第14项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述细胞群包含80％或更多能够产生睾酮的睾丸间质样细胞。

21、16.根据上述第14或15项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述细胞群进行免疫隔离处理。

22、17.一种用于治疗与睾酮降低相关疾病的药物组合物，其包括上述第14或15项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分。

23、18.一种用于细胞移植的组合物，其包括生物相容性膜，上述第14或15项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群粘附在所述生物相容性膜上。

24、19.一种用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，包括用于将多能干细胞衍生的内分泌细胞植入活体的生物相容性膜。

25、20.根据上述第19项所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中所述多能干细胞衍生的内分泌细胞是能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞。

26、21.根据上述第20项所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中，能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞是上述第11项所述的人多干细胞衍生的间质样细胞。

27、a.一种将人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群移植到活体中的方法。

28、b.根据上述a项的移植方法，其中将人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群与细胞群粘附的生物相容性膜一起移植到活体中。

29、c.根据上述a项所述的移植方法，其中将包括生物相容性膜的用于细胞移植的组合物移植到活体中，所述人多能干细胞衍生的间质样细胞群粘附在所述生物相容性膜上。

30、d.根据上述a至c项中任一项所述的移植方法，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群是包括通过包括向人多能干细胞的培养系统中添加选自wnt经典途径激活剂、bmp4、和vegf的一种或多种的步骤的方法产生的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的细胞群。

31、e.一种治疗与睾酮降低相关的疾病的方法，方法包括施用含有人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分的药物组合物。

32、f.一种治疗与睾酮降低相关的疾病的方法，或一种治疗需要睾酮替代的症状的方法，所述方法包括移植用于细胞移植的组合物，所述组合物包括生物相容性膜，其中人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群附着在所述生物相容性膜上。

33、g.根据上述f项所述的治疗方法，其中，所述用于细胞移植的组合物为片状细胞移植组合物。

34、发明的有利效果

35、根据本发明的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，可以制备能够更稳定和持久地分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。此外，由此产生的睾丸间质样细胞可以皮下移植到小鼠体内。