一种基于重组MS2病毒样颗粒递送的HPV-16E7circRNA疫苗

本发明属于生物医药，特别涉及一种基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗。

背景技术：

1、目前，宫颈癌是全世界女性的第三大常见癌症，人乳头瘤病毒(hpv)几乎是所有宫颈癌病例的原因。

2、尽管目前的hpv疫苗在预防感染和肿瘤疾病方面非常有效，但是他们不能清除已经确定的感染。因此，目前人们研究的方向是治疗性疫苗的开发。治疗性人乳头瘤病毒疫苗的设计目标是在宿主中诱导细胞介导的免疫反应，主要由th1细胞驱动，旨在清除现有的病毒感染并减缓或抑制肿瘤进展。当前，人们已经尝试了几种用于开发治疗性疫苗的策略，包括活载体、核酸、肽、基于蛋白质和基于细胞的疫苗以及组合方法。

3、基于活载体的疫苗可分为细菌载体或病毒载体。基于活载体的疫苗可以诱导强烈的细胞和体液免疫反应。基于活载体的疫苗具有很高的免疫原性，并且有许多载体可供选择用于抗原递送。然而，活载体疫苗的主要缺点是它们存在安全风险，尤其是对免疫功能低下的个体而言。使用活载体疫苗的一个障碍是最初接触疫苗时产生抗病毒免疫反应和中和抗体，这限制了后续疫苗给药的有效性。

4、基于肽和基于蛋白的疫苗安全、稳定且易于生产。来源于人乳头瘤病毒抗原的肽和蛋白质由树突状细胞加工并呈递于i类或ii类主要组织相容性复合物(mhc)分子上，以刺激cd8+或cd4+t细胞应答。基于肽的疫苗是mhc特异性的，这使它们不太可能成为大规模生产和治疗的候选疫苗。基于蛋白质的疫苗内有许多cd4+和cd8+t表位，并规避了短肽疫苗接种的缺点，不再受到mhc限制。然而，抗原优先通过mhcii类呈递，这导致产生抗体而不是效应细胞毒性t淋巴细胞(ctls)。因此，我们需要通过一些辅助手段加强内源性加工，或将抗原靶向到dc细胞，以达到诱发细胞免疫的目的。

5、dna疫苗接种涉及将编码目的蛋白质的质粒dna递送到宿主组织中，随后通过细胞转染，导致转基因的表达和能够进入细胞处理机制的蛋白质的产生。具有生产简单、成本较低、热稳定性好的优势。dna疫苗通常通过肌肉注射给药。注射后，dna可被肌细胞或树突状细胞吸收，树突状细胞在向cd8+细胞毒性t细胞呈递抗原方面发挥着关键作用，这是通过外源性抗原摄取或疫苗接种直接转染来实现的。使用dna疫苗的一个重要限制是裸dna的免疫原性低，因为它不能从转染细胞扩增和扩散到周围细胞。

6、因此，如何开发一种安全性高、可有效抑制肿瘤生长的新型hpv治疗性疫苗，是一个需要解决的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的问题，本发明提出了一种基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗。作为一种治疗性疫苗，ms2 vlp递送的circrna免疫可以作为一种有效的癌症免疫疗法来抑制体内肿瘤生长。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、本发明第一方面提供了一种hpv-16 e7circrna，包含五个元件，分别为载体拓扑结构、5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(ires)和招募病毒颗粒组装起始机制的适配体(tr)，序列如seq id no.1所示。

4、本发明第二方面提供了一种基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)hpv-16 e7circrna的序列设计与优化：

6、所述circrna包含五个元件，分别为载体拓扑结构、5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(ires)和招募病毒颗粒组装起始机制的适配体(tr)，序列如seq id no.1所示；

7、在所述circrna的3’端添加19nt的pac位点茎环，获得优化后circrna序列；

8、(2)原核共表达质粒的构建

9、将噬菌体ms2外壳蛋白序列插入到prsf-duet1的ncoi/hindiii克隆位点中，同时将步骤(1)优化后的cirrna序列插入到prsf-duet1的ndei/ngomiv克隆位点中并进行密码子优化，构建得到原核共表达质粒；

10、编码噬菌体ms2外壳蛋白的核酸序列如seq id no.2所示；

11、(3)ms2 circrna-vlps原核表达与纯化

12、将所述原核共表达质粒转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中，通过加入异丙基-β-d-硫半乳糖苷诱导ms2 circrna-vlps的表达，收集菌液；超声破碎菌体后，peg6000浓缩病毒样颗粒后通过蔗糖密度梯度离心和凝胶层析进一步纯化，最终获得ms2 circrna-vlps，即为基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗。

13、本发明第三方面提供了由上述方法制备得到的基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗。

14、本发明第四方面提供了一种所述circrna疫苗在制备治疗宫颈癌的药物方面的应用。

15、本发明的优点和有益效果是：

16、1、为了开发一种能抵抗核酸酶降解的mrna疫苗，本发明采用了基于ms2vlp(噬菌体样颗粒)体内自组装包裹rna方法。该方法将目标circrna包装在ms2噬菌体外壳蛋白内，得到的所述hpv-16 e7circrna疫苗不仅在大肠杆菌表达系统中显示高产量，具有抵御核酸酶(与核酸酶一起孵育至少48小时保持稳定不降解)、不可复制和非传染性等优势、同时能被dc细胞吞噬表达。

17、2、本申请所述基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16 e7circrna疫苗，安全、肌肉给药无明显不良反应；在tc-1宫颈癌肿瘤模型免疫评价中，基于ms2 vlp的hpv-16e7circrna疫苗诱导了强烈的细胞免疫反应，特别是抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的产生和同时降低了髓源性抑制细胞(mdsc)的免疫抑制作用，有效抑制c57bl/6小鼠体内肿瘤生长。相比于通过lnp递送e7circrna，ms2 vlp递送效果更好且具有一定优势。

1.一种hpv-16e7circrna，其特征在于，所述circrna包含五个元件，分别为载体拓扑结构、5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(ires)和招募病毒颗粒组装起始机制的适配体(tr)，序列如seq id no.1所示。

2.一种基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16e7circrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.一种基于重组ms2病毒样颗粒递送的hpv-16e7circrna疫苗，其特征在于，所述疫苗由如权利要求2所述方法制备得到。

4.一种如权利要求3所述circrna疫苗在制备治疗宫颈癌的药物方面的应用。