蜻蜓凤梨AfGF14i基因、克隆方法、表达载体及应用

本发明属于分子生物学和生物，涉及蜻蜓凤梨afgf14i基因的克隆、表达载体构建、亚细胞定位及对开花的调控作用。

背景技术：

1、凤梨科植物(bromeliaceae)是广泛分布于热带和亚热带地区的多年生单子叶植物，共包含58个属，3000多个种，从用途上可分为食用凤梨(菠萝)和观赏凤梨。观赏凤梨又名凤梨花或菠萝花，是仅次于兰花和红掌的第三大热带花卉，因品种繁多，株型优美，花型奇特，花色艳丽，花期长而深受喜爱。

2、蜻蜓凤梨(aechmeafasciata)为光萼荷属(aechmea)观赏凤梨，又名白纹蜻蜓珊瑚、斑粉菠萝或粉菠萝，是观赏凤梨的模式作物。蜻蜓凤梨的花呈桃红色，层次开放，花期长达数月，花朵凋谢后，粉红色的苞片仍可保持数月，因此具有极高的观赏价值。

3、14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中的调控蛋白，在不同生物间高度保守。目前已在拟南芥、水稻、芒果、马铃薯、棉花、苹果等多种作物中报道14-3-3蛋白参与调控植物的开花转变。已有研究表明，14-3-3蛋白作为“衔接分子”，连接成花素flowering locust(ft)和转录因子flowering locusd(fd)，形成三元复合体—成花素激活复合体(florigenactivation complex,fac)，激活下游的花分生组织决定基因表达，从而诱导开花。

4、通过蜻蜓凤梨比较转录组信息分析，获得了14-3-3基因的片段，blast比对显示与其他植物中14-3-3蛋白家族的gf14iota基因均具有较高的同源性，故命名为afgf14i。利用pcr克隆了基因的cds序列并构建表达载体，在烟草叶片上瞬时表达后，荧光显微检测显示afgf14i基因编码蛋白的亚细胞定位为细胞膜，在拟南芥中过表达后拟南芥明显早花，说明蜻蜓凤梨afgf14i基因具有促进开花的功能。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种蜻蜓凤梨afgf14i基因，具体是通过提取蜻蜓凤梨总rna，反转录合成cdna，以此为模板，设计特异引物，利用pcr方法获得afgf14i基因的全长cds，与载体连接，转化大肠杆菌trans-t1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨afgf14i基因，该基因的cds全长729bp。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种蜻蜓凤梨afgf14i基因，该基因序列具有序列表中seq id no.1所示的核苷酸序列。

3、本发明的另一目的在于提供一种蜻蜓凤梨afgf14i基因的克隆方法，包括以下步骤：

4、(1)以蜻蜓凤梨(aechemiafasciata)为材料，利用ctab法提取总rna；

5、(2)afgf14i基因的克隆；

6、(2-1)cdna模板合成利用one-step gdna removal and cdnasynthesis supermix(transgene)试剂盒，作为pcr模板备用；

7、(2-2)设计全长cds扩增引物；

8、afgf14i基因cds全长克隆引物

9、 引物名称 序列(5′-3′) tm(℃) afgf14i-f atggagagggagaaccatgt 57.0 afgf14i-r ttattctacattacctccatcctcagg 56.7

10、(2-3)根据引物的tm值进行pcr条件的优化后，进行pcr扩增，并将获得的产物连接到载体，并转化大肠杆菌感受态trans-t1，经菌落pcr鉴定后进行测序。

11、pcr体系及条件为：

12、 ingredient amount(μl) 2×taqmastermix 25 forwardprimer(10μm) 2 reverseprimer(10μm) 2 <![cdata[ddh₂o]]> 20 cdna 1 totalvolume 50

13、

14、获得全长的cds为729bp，编码一个具243个氨基酸的序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明其具有14-3-3家族保守功能结构域，与己发表的菠萝、油棕、小粒咖啡gf14iota蛋白的氨基酸同源性分别头98％、98％、91％。

15、进一步地，步骤(1)总rna的提取具体如下：

16、(1-1)实验过程中所用研钵需提前进行180℃，5h高温灭菌，冷却至室温后备用，移液枪、实验台需用酒精擦拭，离心管、枪头均无rna酶；

17、(1-2)取850μl ctab缓冲液于2ml离心管中，65℃水浴预热；

18、(1-3)称取约0.2g材料于加有液氮的研钵中充分研磨，待材料研磨成呈粉末状后即可转入(1-2)中预热的ctab缓冲液中，加入材料前，先加入25μlβ-巯基乙醇；

19、(1-4)涡旋30s充分混匀，65℃水浴6min；

20、(1-5)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温条件下11000rpm离心15min；

21、(1-6)吸取上清于新的2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；

22、(1-7)吸取上清于新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8m licl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10-12h；

23、(1-8)4℃条件下，11000rpm离心30min，弃上清；

24、(1-9)加入1ml由depc水配制的75％乙醇，温和震荡离心管，4℃，8000rpm离心5min，弃上清。重复两次，充分洗涤沉淀；

25、(1-10)超净工作台内风干沉淀后，加入30～40μl rnase-free水溶解沉淀。

26、(1-11)用simplinano微量分光光度计测定rna的浓度与纯度，取2μl样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。rna样品于-80℃保存备用，尽快进行下游实验，以免rna降解。

27、进一步地，步骤(2-2)中的扩增引物包括afgf14i-f和afgf14i-r的序列。序列分别如序列表中的seq id no.2、seq id no.3所示。

28、本发明的另一目的是还提供了一种含有蜻蜓凤梨afgf14i基因为目的基因的高效表达载体。

29、进一步地，本发明所述的载体是将蜻蜓凤梨afgf14i基因插入到植物表达载体camv35s-yfp上，构建成在camv35s启动子下游含有蜻蜓凤梨afgf14i基因的高效表达载体。

30、上述蜻蜓凤梨afgf14i基因表达载体的构建，具体步骤如下：

31、(1)根据已测序的afgf14i基因cds序列，设计在5’端加上27bp含kp n i酶切位点的同源重组接头的上游引物p1(具体如序列表中的seq id no.4所示：5’-ctctcgagctttcgcgagctcggtaccatggagagggagaaccat gt-3’)和27bp含xbal i酶切位点的同源重组接头的下游引物p2(具体如序列表中的seq id no.5所示：5’-gggaccggtcctcgagacgtctctagattctacattacctccatcctcaggc-3’)；

32、(2)以afgf14i基因测序验证正确的质粒为模板，pcr扩增带有载体同源臂的cds全长；

33、(3)利用kpn i和xba i限制性内切酶将camv35s-yfp载体线性化；

34、(4)采用clonexpresstmiione step cloning kit(vazyme)构建重组载体；

35、(5)经菌落pcr及测序验证后获得afgf14i基因的超表达载体camv35s-afgf14i-yfp。

36、本发明还提供了一种蜻蜓凤梨afgf14i基因编码蛋白的亚细胞定位。

37、具体是通过在烟草叶片上瞬时表达分析afgf14i基因编码蛋白的亚细胞定位。将构建好的携带有afgf14i基因cds序列的表达载体camv35s-afgf14i-yfp转入农杆菌eha105后，注射本氏烟(nicotiana benthamiana)烟草叶片，利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号分布情况，确定afgf14i蛋白的亚细胞定位。观察发现afgf14i蛋白分布于细胞膜。

38、本发明的还提供蜻蜓凤梨afgf14i基因在对植物开花方面的应用，具体是对拟南芥开花的影响。

39、具体是利用农杆菌介导法转化拟南芥，将构建好的带有afgf14i基因cds序列的表达载体camv35s-afgf14i-yfp转入农杆菌eha105后，侵染野生型拟南芥columbia(col-0)的花序，收获t0代转基因种子。将t0代种子消毒后播种于含有30mg/l潮霉素的ms固体培养基上进行抗性筛选，获得t1代转基因阳性植株。t1代的种子继续播种到含有40mg/l潮霉素的ms固体培养基上进行抗性筛选，获得t2代转基因阳性植株，并进行单株收种。t2代的种子继续进行抗性筛选，通过观察t3代表型是否分离及分子水平鉴定是否为纯合体植株。观察发现，与野生型拟南芥相比，t3代的转基因阳性株系明显早花。

40、本发明的有益效果：

41、本发明将afgf14i基因cds序列构入到植物表达载体camv35s-yfp上，构建一个新的植物表达载体，命名为camv35s-afgf14i-yfp。该基因会影响拟南芥开花。因此，afgf14i基因的获得为研究蜻蜓凤梨开花机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中乙烯催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。