一种富含胎儿样肠干细胞的肠类器官获取及无生长因子培养方法

本发明涉及生物，具体地涉及培养基的开发及其应用，涵盖了一种特殊的培养基及其在生物医学研究和治疗中的用途，更具体地，本发明提供了一种富含胎儿样肠干细胞的肠类器官获取及无生长因子培养方法。

背景技术：

1、肠道是人体中极为关键的消化和吸收器官，它不仅负责将食物分解成可被机体吸收的营养成分，为生命活动提供必需的营养和能量，还具有防止肠道内的有害物质，如细菌和毒素，穿过肠黏膜进入人体的功能，从而为人体提供了一道重要的保护屏障。在肠上皮中，存在着多种类型的干细胞，包括活跃型成体干细胞和静息型成体干细胞，它们是肠道中众多上皮细胞的来源。近年来，研究揭示了一种新型的肠上皮干细胞——胎儿样肠干细胞，它们同样具备分化为多种肠上皮细胞的潜力。因此，对这类干细胞的研究具有极其重要的意义。

2、目前，科学界尚未开发出一种成熟的技术来大规模培养胎儿样肠干细胞。这一领域仍处于探索阶段，需要进一步的研究和创新来克服现有的挑战。而在小鼠肠类器官的培养方法中，通常需在基础培养基中添加必要的生长因子，如egf、noggin和r-spondin(简称enr)。然而，这些生长因子不仅成本高昂，而且储存不当容易失效，这限制了依赖这些生长因子的培养体系在大规模培养胎儿样肠干细胞方面的应用，进而影响了对其进一步研究的进展。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种富含胎儿样肠干细胞的肠类器官获取及无生长因子培养方法，本发明提供的培养基包括基础培养基、血清替代物，抗生素、谷氨酸盐/酯、hepes缓冲液、前列腺素e2、chir-99021和2-丙基戊酸，其中以三种小分子药物前列腺素e2、chir-99021和2-丙基戊酸取代生长因子。将包裹在基质胶中的肠隐窝或胎儿样肠干细胞置于上述培养基中进行培养，能够实现对胎儿样肠干细胞的获取和/或培养。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于获取和/或培养胎儿样肠干细胞的培养基，包括基础培养基、血清替代物，抗生素、谷氨酸盐/酯、hepes缓冲液、前列腺素e2、chir-99021和2-丙基戊酸，其中所述前列腺素e2的浓度为3-7μg/ml，所述chir-99021的浓度为2-5μm，所述2-丙基戊酸的浓度为1-3mm，所述培养基中不含有生长因子egf、noggin和r-spondin。

3、其中，前列腺素e2(简称p)是前列腺素的一种，具有调节血压、炎症反应、促进细胞增殖和分化等多功能，chir-99021(简称c)是一种gsk3β抑制剂，可介导β-catenin降解，2-丙基戊酸(valproic acid，简称v)是一种hdac抑制剂，能够激活notch信号通路。

4、进一步地，所述基础培养基为dmem/f12完全培养基。

5、进一步地，所述血清替代物为n2和b27。

6、进一步地，所述抗生素为青霉素和链霉素。

7、进一步地，所述谷氨酸盐/酯为glutamax，所述glutamax的浓度为2mm。

8、优选地，所述前列腺素e2的浓度为5μg/ml。

9、优选地，所述chir-99021的浓度为3μm。

10、优选地，所述2-丙基戊酸的浓度为2mm。

11、在本发明的一个实施例中，一种胎儿样肠干细胞的培养基包含基础培养基advanced dmem/f12、血清替代物n2-max supplement(1:100)和b27supplement(1:50)、双抗、谷氨酸盐/酯glutamax(2mm)、1m的hepes缓冲液、5μg/ml的前列腺素e2、3μm的chir99021和2mm的2-丙基戊酸。

12、根据本发明的实施例，所述培养基能够在将体外培养的小肠类器官去分化为富含胎儿样肠干细胞的肠类器官，并且后者能够正常生长。

13、本发明的第二个目的是提供前列腺素e2、chir-99021和2-丙基戊酸在制备培养基中的应用，所述培养基用于体外获取或培养胎儿样肠干细胞，所述体外获取为使肠上皮细胞转化为胎儿样肠干细胞；

14、所述前列腺素e2的浓度为3-7μg/ml，所述chir-99021的浓度为2-5μm，所述2-丙基戊酸的浓度为1-3mm，所述培养基中不含有生长因子egf、noggin和r-spondin。

15、优选地，所述前列腺素e2的浓度为5μg/ml。

16、优选地，所述chir-99021的浓度为3μm。

17、优选地，所述2-丙基戊酸的浓度为2mm。

18、进一步地，所述肠上皮细胞来源于小肠。

19、进一步地，所述肠上皮细胞为小鼠肠上皮细胞。

20、本发明的第三个目的是提供一种体外获取胎儿样肠干细胞的分化培养方法，将包裹在基质胶中的肠隐窝置于上述培养基中进行培养。

21、进一步地，所述肠隐窝分离自小肠。

22、进一步地，所述培养在5％co2环境下进行。

23、进一步地，所述培养在无菌和37℃条件下进行。

24、在本发明的一个实施例中，所述培养的时间为48小时。

25、在本发明的一个实施例中，肠隐窝的分离方法包括以下步骤：

26、(1)取小肠放入预冷的无菌dpbs缓冲液中，冲洗消化残留物和粪便，并将小肠处理成小块肠段；

27、(2)将肠段放于预冷dpbs缓冲液中，并将其置于冰上，以20rpm的速度在摇床上轻轻摇动5分钟，进行二次清洗；

28、(3)弃去dpbs加入含有2mm edta的预冷dpbs缓冲液，继续在冰上以20rpm的速度摇动30分钟；

29、(4)随后弃去含有2mm edta的dpbs缓冲液，加入含有55mm山梨糖醇和43mm蔗糖的预冷dpbs缓冲液，快速剧烈使隐窝从肠管上脱落；

30、(5)使用70μm孔径的无菌细胞筛过滤缓冲液，隐窝将留在过滤后的缓冲液中；

31、(6)将过滤后的缓冲液在4℃下，以900rpm的速度离心5分钟，收集纯净的小肠隐窝细胞。

32、本发明的第四个目的是提供一种胎儿样肠干细胞的培养方法，将包裹在基质胶中的胎儿样肠干细胞置于上述培养基中进行培养，所述胎儿样肠干细胞是通过上述方法获取的。

33、进一步地，所述培养在5％co2环境下进行。

34、进一步地，所述培养在无菌和37℃条件下进行。

35、本发明的有益效果：

36、(1)本发明采用前列腺素e2、chir-99021和2-丙基戊酸替代enr等生长因子，成本较低且易于储存，并且小分子药物不改变固有生物学性质，如基因组信息，使得该种培养方式具有方法学意义。相较于传统的培养基，根据本发明实施例的不含生长因子的培养基能够使得胎儿样肠干细胞正常生长。

37、(2)利用本发明提供的培养基体外培养小肠类器官，能够增加胎儿样肠干细胞标记基因sca1和trop2表达，降低成体肠干细胞标记基因lgr5、ascl2、hopx、lrig1和tert等的表达，抑制wnt信号通路相关基因的表达，这说明本发明提供培养基能够将普通肠类器官诱导转化为富含胎儿样肠干细胞的肠类器官，不仅解决了胎儿样肠干细胞培养问题，还解决了胎儿样肠干细胞难以获取的问题。

38、(2)本发明提供的胎儿样肠干细胞体外获取和/或培养的方法，不仅简化了胎儿样肠干细胞的培养过程，使小肠上皮细胞在体外条件下去分化为胎儿样肠干细胞，并保持正常生长，为胎儿样肠干细胞的体外培养系统和获取方法的推广提供了有力支持，有利于实现胎儿样肠干细胞的体外大量扩增，为深入研究胎儿样肠干细胞提供了一个极具价值的平台。