一种提高丙烯酸酯基底生物分子偶联效率的方法

本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种提高丙烯酸酯基底生物分子偶联效率的方法。

背景技术：

1、光盘是一种常见的用于数据储存的介质。由于光盘具有优异的光学性能(反射和吸收)和光滑的表面结构(1-10nm的表面粗糙度)，近年来已有许多研究揭示了其代替传统的玻璃、硅片等作为新一代生物反应基底的优势，成功应用于物质的定性或定量分析中。光盘的保护层(表层)通常由紫外光固化丙烯酸酯制成，即紫外光固化丙烯酸酯基底。

2、现有技术中，利用光盘作为生物反应基底进行定性或定量分析的方法主要有如下几种：

3、(1)利用标准光驱进行检测：其原理在于光驱内的激光头首先利用高功率或低功率的激光将要记录的信息对光盘的染料层进行刻蚀，染料层在高功率激光的刻蚀下形成凹坑，而低功率激光对染料层无影响。经过连续的刻蚀，染料层出现一连串的凹坑和凸起，代表着二进制信息。当读取光盘时，由于凹坑与凸起的反射率不同，光驱接收到两种不同的光强信号分别代表着二进制0和1，而当光盘表面存在污染物时将干扰正常的数据读取过程产生纠错码，其数值与污染物的数量呈正比，以此实现定性或定量检测。如kido等人在普通cd表面构建了荧光标记蛋白微阵列免疫结构，并用标准光驱读取生物光盘进行检测。于等人在普通cd、bd表面构建了免疫分析阵列，利用金标抗体和银增强策略，结合标准光驱和光盘质量诊断软件实现了生物分子的定量检测。

4、(2)光驱改造检测：alexander等人将普通光驱改造成具有两个光电探测器的光驱，获取了cd表面制备的生物反应阵列上dna的信息。barathur等人将标准光驱改造成激光扫描仪，实现了微流控光盘的检测。lange等人利用光驱激光头精密的聚焦和循迹功能将其结合光学显微镜改装为光驱成像仪，进行了免疫反应的成像分析。光驱改造检测方案虽能对生物分子进行定性或半定量检测，但其涉及到对光驱内部光电结构的重新设计，同时也通常需要对光盘进行破坏性重构，实际可操作性不强。

5、以上以生物光盘为反应基底的检测方法能够对负载的生物分子进行定性或半定量分析，但无法进行准确且高灵敏度的定量检测。关键原因之一是光盘表面保护层的主要成分为丙烯酸酯，其生物惰性较强，导致生物光盘表面抗体偶联效率较低，这将直接影响检测灵敏度和准确性。提高生物光盘表面抗体偶联效率是提高光盘检测平台检测性能的关键之一，也是该领域的研究热点所在。目前，针对cd或bd光盘表面改性从而提高抗体偶联效率的方法主要有以下几种：

6、(1)紫外线处理：该方法主要利用紫外线照射在光盘表面硬化层形成氧化膜的同时引入羟基、羧基、氨基等，通过edc/nhs介导的胺偶联反应实现抗体的共价偶联。

7、(2)旋涂易被活化物质su-8：该方法主要将易于活化的su-8光刻胶通过旋涂仪、恒温烤炉、紫外灯等设备固定于光盘硬化层表面。

8、(3)碱性水解：该方法主要利用naoh等强碱水溶液对光盘表面硬化层中的聚丙烯酸酯成分进行碱水解，以在其表面形成羧酸盐等亲水性基团，随后通过edc/nhs介导的胺偶联反应实现抗体的共价偶联。

9、(4)物理吸附：该方法主要利用生物点样仪将生物分子直接点样在光盘表面，利用物理吸附作用使生物分子吸附于光盘表面。

10、但是，采用上述方法对光盘表面进行表面改性以及偶联抗体的效果仍然存在缺陷，具体体现在：

11、(1)紫外线处理：处理过程中操作者可能有暴露于紫外线的风险，生成的活性基团数量少，且仅有羧基或氨基其中一种基团能通过后续edc/nhs反应连接抗体，偶联效率低。

12、(2)旋涂易被活化物质su-8：该方法操作复杂、原料昂贵、工艺要求高，且由于在光盘表面旋涂了一层su-8，其折射率的干扰可能会影响生物信号的采集过程。

13、(3)碱水解效率不高，且naoh等强碱水溶液由于操作不当可能会造成操作人员皮肤、眼部等部位的灼伤，强碱废液对环境有害。

14、(4)物理吸附：相比于上述共价结合的方法，物理吸附的固定效率和反应效率都较低。

15、综上所述，亟需研发一种经济、环保、简便的能够显著提高生物光盘表面抗体偶联效率的方法，以满足利用光盘作为生物反应基底进行定性或定量分析的应用需求。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种提高丙烯酸酯基底表面生物分子偶联效率的方法，以解决现有技术缺少经济、环保、简便的将生物分子等生物分子偶联到丙烯酸酯基底表面的方法的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种提高丙烯酸酯基底表面生物分子偶联效率的方法，对丙烯酸酯基底进行等离子体处理；然后使用桥接缓冲液浸泡丙烯酸酯基底；使用活化缓冲液浸泡丙烯酸酯基底，获得的处理后的丙烯酸酯基底用于偶联抗体；

4、所述桥接缓冲液中的活性物质为含有丁二酸酐的硅氧烷；所述活化缓冲液中的活性物质包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶和o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯中的至少一种。

5、进一步，含有丁二酸酐的硅氧烷包括二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮、[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐和琥珀酸酐封端的聚二甲基硅氧烷中的至少一种；

6、含有丁二酸酐的硅氧烷的浓度为5-30％，桥接缓冲液使用pbs缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液、tris缓冲液中的至少一种配制。

7、进一步，等离子体处理的条件为：氧气气压0.05-0.2bar，功率20-80w，处理时间30-180s；

8、活化缓冲液使用吗啉乙磺酸溶液或者磷酸盐缓冲液配制；使用活化缓冲液浸泡光盘保护层的时间为5-15min。

9、进一步，在使用活化缓冲液浸泡光盘保护层之前，采用＞120℃的温度对光盘保护层进行干燥处理；干燥处理的温度为120-160℃，时间为5-20min。

10、进一步，所述丙烯酸酯基底来自于生物光盘的保护层。

11、本技术方案还提供了一种将偶联生物分子至丙烯酸酯基底的方法，包括以下依次进行的步骤：

12、s1洗涤丙烯酸酯基底：使用甲醇和乙醇的混合溶液洗涤丙烯酸酯基底，然后用氮气吹干；

13、s2等离子体处理：使用氧等离子体处理丙烯酸酯基底；

14、s3硅氧烷桥接：使用桥接缓冲液浸泡丙烯酸酯基底；所述桥接缓冲液中的活性物质为含有丁二酸酐的硅氧烷；

15、s4基底活化：使用活化缓冲液浸泡丙烯酸酯基底；所述活化缓冲液中的活性物质包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶和o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯中的至少一种；

16、s5偶联抗体/抗原：将抗体/抗原溶液滴加于丙烯酸酯基底，经孵育获得偶联有抗体的丙烯酸酯基底。

17、进一步，在s1中，甲醇和乙醇的混合溶液由体积比为(4-7)：(6-3)的甲醇和无水乙醇组成；洗涤时间5min；

18、在s2中，等离子体处理的条件为：氧气气压0.05-0.2bar，功率20-80w，处理时间30-180s。；

19、在s3中，桥接缓冲液由如下方法配制：将二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮溶于pbs缓冲液中，再经超声处理10-20min后即得；二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮的浓度为5-30％；浸泡时间为12-16h；

20、或者，将琥珀酸酐封端的聚二甲基硅氧烷溶于pbs缓冲液中，再经超声处理10-20min后即得；琥珀酸酐封端的聚二甲基硅氧烷的浓度为5-30％；浸泡时间为12-16h；

21、或者，将[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶于pbs缓冲液中，再经超声处理10-20min后即得；[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐的浓度为5-30％；浸泡时间为12-16h；

22、在s4中，活化缓冲液由如下方法配置：使用0.05-0.1mol/l吗啉乙磺酸溶液，并使1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的终浓度为100-150mmol/l，n-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为25-37.5mmol/l；

23、或者，使用0.05-0.1mol/l吗啉乙磺酸溶液，并使1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的终浓度为100-150mmol/l，4-二甲基氨基吡啶的终浓度为15-30mmol/l；

24、或者，使用0.05-0.1mol/l吗啉乙磺酸溶液，并使二环己基碳二亚胺的终浓度为40-80mmol/l，4-二甲基氨基吡啶的终浓度为8-16mmol/l；

25、或者，使用0.01mol/l的磷酸盐缓冲液，并使o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯的终浓度为40-100mmol/l；

26、使用上述活化缓冲液浸泡丙烯酸酯基底5-15min；

27、在s5中，抗体溶液中抗体的浓度为50-500μg/ml；孵育温度为25-37℃，孵育时间为3-6h。

28、进一步，在s4中，先采用120-160℃的温度对丙烯酸酯基底进行干燥处理5-20min，然后使用活化缓冲液浸泡丙烯酸酯基底。

29、本技术方案还提供了一种将生物分子偶联至丙烯酸酯基底的方法获得的偶联有生物分子的生物光盘。

30、本技术方案还提供了一种偶联有生物分子的生物光盘在制备生物反应基底中的应用。

31、综上所述，本发明的原理以及有益效果在于：

32、本发明公开了一种能够显著提高生物光盘表面抗体偶联效率的方法，以解决传统生物光盘表面抗体偶联过程中处理方法不环保、生物危害性大、偶联效率低、偶联不均匀的关键技术问题。本发明方法中，材料及试剂包括普通光盘(可以是bd、dvd、cd等数字光盘)、洗涤缓冲液(可以是甲醇、乙醇或者特定配比的甲醇/乙醇混合液)、桥接缓冲液(可以是二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮、[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐、琥珀酸酐封端的聚二甲基硅氧烷等含有丁二酸酐部分的硅氧烷水溶液)、活化缓冲液(可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺混合液以及4-二甲基氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯不同配比的混合液)和包被缓冲液(含抗体)组成。本发明方法以二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮等含有丁二酸酐部分的硅氧烷为桥接剂，利用其具有的丁二酸酐官能团与抗体氨基共价结合，实现抗体的高效率均匀偶联。本方案的生物安全性高、对环境友好，避免了传统生物光盘表面活化方法中紫外线、强碱、su-8等具有显著生物危害效应物质的使用。本发明中使用的有机硅氧烷分子二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮等含有丁二酸酐部分的硅氧烷的si-o骨架可以与任何含有oh基团的表面形成稳定的共价键，使用氧等离子体处理光盘表面保护层使其生成大量羟基，能够实现桥接缓冲液中二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮、[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐、琥珀酸酐封端的聚二甲基硅氧烷与生物光盘表面的共价结合。具有丁二酸酐末端的硅氧烷分子可实现双重抗体偶联，该分子的丁二酸酐官能团可以和抗体的氨基之间通过开环反应直接产生共价酰胺键有效偶联抗体，同时其产生的羧基官能团也能与抗体分子产生偶联。在使用含有丁二酸酐部分的硅氧烷进行桥接的过程中，发明人也发现了硅氧烷的浓度对抗体偶联效果会产生比较显著的影响，只有在适当浓度下，才能获得显著高于其他的偶联效率。除此之外，在硅氧烷和生物光盘保护层桥接之后，如果对光盘进行干燥处理，则有必要采取高温干燥处理的方式，然后再对光盘表面进行活化处理，接下来再进行后续的抗体连接，否则，抗体连接效率非常低，难以实现后续的检测目的。除此之外，在硅氧烷和光盘保护层桥接之后，可不采用任何形式的干燥处理方式，直接进行官能团活化，上述方式相对于干燥处理的方式可以保证更高的抗体连接率。因此，本发明创建的一种提高生物光盘表面抗体偶联效率的方法具有高效、经济、环保、简便的特点，能够显著提高生物光盘表面抗体偶联效率，为基于生物光盘开展的生物检测提供了有效的抗体偶联策略，具有极大的推广应用价值。

33、综上，本技术方案仅需通过简单的等离子体处理，引入桥接剂和活化步骤即可制备具有高表面抗体结合力的生物光盘反应基底。经测试，通过本方法制备得到的生物光盘反应基底的荧光抗体偶联效率明显提高，偶联信号均匀，解决了传统生物光盘表面抗体偶联过程中处理方法不环保、生物危害性大、偶联效率低、偶联不均匀的关键技术问题。