一种清上蠲痛汤中挥发油特征图谱的构建方法及清上蠲痛汤样品的检测方法与流程

本发明涉及中药分析和中药质量控制领域，具体涉及一种清上蠲痛汤中挥发油特征图谱的构建方法，以及利用该特征图谱的清上蠲痛汤样品的检测方法。

背景技术：

1、清上蠲痛汤录于《寿世保元》(作者为明朝龚廷贤)中，为卷六头痛门中第一方，是治疗头痛的名方。2018年中国公布第一批《古代经典名方目录》，本方位列第66首，全方由酒当归，川芎，白芷，细辛，羌活，独活，防风，菊花，蔓荆子，苍术，酒黄芩，麦门冬，甘草十三味组成，具有疏风散寒除湿、行气活血、通络止痛的作用，临床上常用于治疗各种头痛。

2、清上蠲痛汤中含挥发性成分的药味较多，其中：当归挥发油具有降压、改善脑缺血、抗炎镇痛的药理作用；川芎挥发油具有保护心脑血管、解痉、解热、镇痛、抗炎、抗脑缺血的药理作用；细辛挥发油具有麻醉、抗炎、抗癌、抗惊厥、抗抑郁、解热镇痛的药理作用；羌活挥发油具有抗炎、镇痛的药理作用，例如，周毅等人的研究表明，羌活中起镇痛作用的物质不是水溶性成分而是挥发油(周毅等,川产羌活基源及镇痛作用研究[j],中药药理与临床,2003(06):22-23)。

3、目前，有关清上蠲痛汤的研究多集中于临床用药方面，其水溶性成分的指纹图谱、特征图谱、煎煮工艺、含量测定、质量控制等方面也已有相关研究，例如，引用文献1公开了一种清上蠲痛汤特征图谱的构建方法，其以绿原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、蔓荆子黄素和藁本内酯等作为特征组分，但其中作为挥发性成分的特征组分仅有藁本内酯；引用文献2涉及一种清上蠲痛汤的质量控制方法，但其对照品依旧选择了黄芩苷、汉黄芩苷、蔓荆子黄素、甘草酸铵和升麻素苷等非挥发性成分。而针对清上蠲痛汤中发挥药效并起到主要作用的挥发油成分的特征图谱、含量测定、质量控制等方面的研究至今未见报道。

4、综上，目前针对清上蠲痛汤中挥发油的研究深度还远远不够，存在药味定性评价体系不全面，缺乏挥发性指标的质量控制等问题。由于挥发油成分是清上蠲痛汤发挥行气、止痛等临床疗效的主要有效成分，因此有必要建立一种清上蠲痛汤中挥发油成分的特征图谱。

5、引用文献：

6、引用文献1：cn114646707a

7、引用文献2：cn114965734a

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、为了解决现有技术的上述问题，本发明的目的在于提供一种清上蠲痛汤中挥发油特征图谱的构建方法，通过该方法构建的特征图谱可以用于清上蠲痛汤基准样品、制剂中间产品和/或制剂成品等的质量评价，尤其适用于清上蠲痛汤标准汤剂的质量控制与评价。

3、用于解决问题的方案

4、通过发明人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：

5、[1].本发明提供一种清上蠲痛汤中挥发油特征图谱的构建方法，其包括以下步骤：

6、(1)配制挥发油供试品溶液和配制对照品溶液的步骤，其中，所述供试品为清上蠲痛汤基准样品、制剂中间产品和/或制剂成品；所述对照品包括甲基丁香酚、洋川芎内酯a和藁本内酯中的至少一种；

7、(2)检测和建立特征图谱的步骤，其中，采用超高效液相色谱法对所述挥发油供试品溶液和所述对照品溶液进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行结果分析，建立特征图谱；

8、其中，所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：

9、固定相为以烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，

10、流动相a为乙腈，流动相b为水或体积百分比为0.01％～0.1％的磷酸水溶液，

11、按照如下的梯度洗脱程序进行洗脱：

12、

13、[2].根据[1]所述的构建方法，其中，所述特征图谱包含至少3个，优选至少6个，更优选至少9个，进一步优选12个特征峰；

14、当所述特征图谱包含12个特征峰时，其中的8号峰、9号峰、11号峰分别与甲基丁香酚、洋川芎内酯a、藁本内酯对照品的色谱峰相对应；以8号峰为s峰，计算其他特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：1号峰：0.409，2号峰：0.491，3号峰：0.629，4号峰：0.698，5号峰：0.774，6号峰：0.889，7号峰：0.955，8号峰：1，9号峰：1.079，10号峰：1.228，11号峰：1.868，12号峰：2.016。

15、[3].根据[1]或[2]所述的构建方法，其中，所述配制挥发油供试品溶液的步骤包括制备标准汤剂，提取标准汤剂中的挥发油，移取挥发油并用甲醇稀释至浓度为3％～8％。

16、[4].根据[1]～[3]中任一技术方案所述的构建方法，其中，所述对照品溶液为所述对照品在醇或醇-水混合溶剂中的溶液；优选地，所述醇或醇-水混合溶剂为甲醇或甲醇-水混合溶剂，所述甲醇-水混合溶剂为以甲醇的体积分数计为70％～90％的甲醇-水混合溶剂。

17、[5].根据[1]～[4]中任一技术方案所述的构建方法，其中，所述对照品溶液的浓度分别为：甲基丁香酚：2.8～3.7mg/ml，洋川芎内酯a：1.5～2.3mg/ml，藁本内酯：0.05～0.2mg/ml；

18、优选地，所述对照品溶液的浓度分别为：甲基丁香酚：3.340mg/ml，洋川芎内酯a：1.960mg/ml，藁本内酯：0.1mg/ml。

19、[6].根据[1]～[5]中任一技术方案所述的构建方法，其中，所述超高效液相色谱条件还包括：检测波长为210～280nm，流速为0.28～0.32ml/min，柱温为28～32℃；所述检测的进样量为0.5μl。

20、[7].根据[1]～[6]中任一技术方案所述的构建方法，其中，所述色谱柱为c18色谱柱，柱长为100mm，填料粒径为1.6～1.9μm；

21、优选地，所述c18色谱柱选自waters acquity(beh c18 2.1×100mm1.7μm)、waters cortecs c18(2.1×100mm，1.6μm)、thermo gold(hypersil gold 2.1×100mm,1.9μm)中的任意一种。

22、[8].根据[1]～[7]中任一技术方案所述的构建方法，其中，所述供试品为清上蠲痛汤标准汤剂。

23、[9].另外，本发明还提供一种清上蠲痛汤样品的检测方法，其包括如下步骤：

24、以水为溶媒对待测清上蠲痛汤样品进行提取，收集提取液，进一步通过提取制备挥发油待测品溶液；所述清上蠲痛汤样品为清上蠲痛汤基准样品、制剂中间产品和/或制剂成品；进一步地，所述清上蠲痛汤样品为清上蠲痛汤标准汤剂；

25、采用超高效液相色谱法对所述挥发油待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与权利要求1～8任一项所述的构建方法构建的特征图谱进行比较以检测清上蠲痛汤样品的质量；

26、超高效液相色谱条件包括：

27、固定相为以烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，

28、流动相a为乙腈，流动相b为水或体积百分比为0.01％～0.1％的磷酸水溶液，

29、按照如下的梯度洗脱程序进行洗脱：

30、

31、[10].根据[9]所述的检测方法，其中，所述提取溶剂为甲醇或甲醇体积百分比不低于70％的甲醇水溶液；

32、所述检测清上蠲痛汤样品的质量为将所述检测图谱与所述特征图谱进行比较，若二者一致，则所述清上蠲痛汤样品为合格品；

33、若二者不一致，则所述清上蠲痛汤样品为不合格品。

34、发明的效果

35、1、本发明的构建方法确定了12个共有峰作为清上蠲痛汤标准汤剂中挥发油的特征峰，通过质谱解析了全部特征峰的化学信息，其中对照品指认出3个峰，并对特征峰的药味来源进行归属研究，为产品质量的源头追溯提供了科学的实验依据。

36、2、本发明采用超高效液相色谱法进行检测分析，检测时间32min，相比于hplc来说，分析效率高，节约时间，溶剂消耗量少，对环境污染小。

37、3、该方法操作简单，准确可靠。所建立图谱的各特征峰分离度较好，成分专属性较强，重现性好，适用于清上蠲痛汤基准样品、制剂中间产品和/或制剂成品等的质量评价，尤其适用于清上蠲痛汤标准汤剂的质量控制与评价，并且适合规模化生产的检测与监控。

38、4、本发明以提取出的清上蠲痛汤标准汤剂中挥发油作为供试品进行检测，方法所构建的特征图谱能够全面表征清上蠲痛汤中当归、川芎、羌活、细辛4个药味挥发性活性成分的特征和信息，弥补了中药复方制剂中挥发油成分性质复杂、收集困难，检测方法不足等缺陷，对清上蠲痛汤制剂工艺研究提供科学指导，对产品质量进行较为全面的控制与评价，确保药品与临床汤剂的质量和临床疗效的一致性。

39、需要说明的是，上述的记载并不是公开了本发明的全部实施方式和本发明的全部优点。