一种用于食品中真菌毒素纯化的方法及其应用与流程

本发明涉及食品安全检测，具体的说是一种用于食品中真菌毒素纯化的方法及其应用。

背景技术：

1、真菌毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等，具有上百种化合物，对食品安全构成严重威胁。液相色谱和质谱等仪器方法是真菌毒素最常用的可靠的检测技术手段，但需要毒素标准物质作为参照。标准物质的制备就需要高纯度(≥99％)真菌毒素，确定高纯度真菌毒素制备的优化条件具有切实的应用价值。

2、黄曲霉毒素有较多的种类，主要有黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1,afb1)、黄曲霉毒素b2(aflatoxin b2,afb2)、黄曲霉毒素g1(aflatoxin g1,afg1)和黄曲霉毒素g2(aflatoxin g2,afg2)等。由黄曲霉真菌(aspergillus flavus)等产生，它们的结构式不同，其毒性及危害也有很大差异。在食品中的污染最广泛，对食品的安全性影响最大。其毒性随着毒素的剂量、接触时问长短和动物种类、营养状态及饲料不同而异。在动物实验中，大剂量摄入这些毒素会造成死亡；亚致死剂量产生慢性中毒；长期接受低剂量则导致癌症，主要是肝癌。黄曲霉毒素具有极强的毒性和致癌性，引起了世界各国的重视。国际上有60多个国家制订了安全食用限量标准，限量标准为：食品中黄曲霉毒素g2为5μg/kg；食品中黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2总和为10～20μg/kg。黄曲霉毒素b1易溶于苯、甲醇、乙醇等有机溶剂。cas号：1162-65-8。分子结构式：c17h12o6，分子量：312.0634g/mol。黄曲霉毒素b2易溶于苯、甲醇，乙醇等有机溶剂。cas号：7220-81-7。分子结构式：c17h14o6，分子量：314.0790g/mol。黄曲霉毒素g1易溶于苯、甲醇，乙醇等有机溶剂。cas号：1165-39-5。分子结构式：c17h12o7，分子量：328.0583g/mol。黄曲霉毒素g2易溶于苯、甲醇、乙醇等有机溶剂。cas号：7241-98-7。分子结构式：c17h14o7，分子量：330.0740g/mol。

3、赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是重要的真菌毒素之一，是赭曲霉(aspergillus ochraceus)、洋葱曲霉(aspergillus alliaceus)、鲜绿青霉(pencilliumviridicatum)、徘徊青霉等代谢产生。赭曲霉毒素a是赭曲霉毒素中毒性最强的物质，主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过5mg/kg时，就会对肝脏组织和肠产生破坏，引起肠炎、肝肿大等。不同动物种属对赭曲霉毒素敏感性不同。我国规定赭曲霉毒素a在谷类、豆类中的限量为5μg/kg，饮料类最高含量为10μg/kg。赭曲霉毒素a易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂。cas号：303-47-9。分子结构式：c20h18o6ncl，分子量：403.08g/mol。

4、展青霉素(patulin,pat)，又叫棒曲霉毒素或珊瑚青霉毒素，主要是由棒曲霉(aspergillus clavatus)、扩展青霉(pencillium expansum)等代谢产生的一种免疫抑制剂，是一种神经毒素，其能诱发实验动物肿瘤，并对消化系统和皮肤组织具有损害作用。对试验动物有较强的毒性，使鼠类急性中毒主要表现为痉挛、肺出血水肿、皮下组织水肿、肾淤血变性、无尿直至死亡。我国规定了水果、饮料、酒类等食品中的限量标准50μg/kg。展青霉素(patulin,pat)，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。酸性条件下结构稳定，对光较敏感。cas号：149-29-1。分子结构式：c7h6o4，分子量：154.0266g/mol。

5、玉米赤霉烯酮(zearalenone,zon)又名f-2毒素，产毒菌主要是镰刀菌属的菌株，如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等。玉米赤霉烯酮主要污染玉米，也可污染大麦、小麦、大米、小米、燕麦等粮食作物。食品含有玉米赤烯酮可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、精神抑郁等。我国规定小麦、玉米中的玉米赤霉烯酮的限量为60μg/kg。玉米赤霉烯酮化学性质稳定，耐高温，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。酸性条件下结构稳定，对光较敏感。cas号：17924-92-4。分子结构式：c18h22o5，分子量：318.1467g/mol。

6、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,don)是一种单端孢霉烯族毒素,主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(fusarium culmorum)等产生。中毒症状主要表现为腹部不适如恶心、呕吐、腹泻等，严重时甚至可能损害造血系统以致死亡；而长期低剂量接触可引起厌食症，生长迟缓，免疫失调，生殖和发育障碍等。我国规定谷物及其制品中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量不得超过1000μg/kg。脱氧雪腐镰刀菌烯醇常温状态下是一种无色针状结晶,熔点为151～153℃,可溶于水和极性溶剂,一般可长期保存在乙酸乙酯中。cas号：51451-10-8。分子结构式：c15h20o6，分子量：297.32g/mol。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于食品中真菌毒素纯化(纯度≥99％)的方法及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种用于食品中真菌毒素纯化的方法，将待纯化真菌毒素通过全扫描紫外吸收，根据待测毒素和杂质响应确定检测波长，并通过液相色谱对其进一步纯化2-3次，即可获得纯度可达99％以上的用于食品中真菌毒素检测的标准样品。

4、进一步的说，检测波长根据待测毒素和杂质的出峰情况，即，主峰响应最大、杂质最多且响应最大的检测波长，作为检测波长。

5、所述食品中真菌毒素为黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a、展青霉素、玉米赤烯酮或脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

6、具体为：

7、将待纯化黄曲霉毒素b1溶液，检测波长为360nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝30:70，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的黄曲霉毒素b1；

8、将待纯化黄曲霉毒素b2溶液，检测波长为360nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝30:70，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的黄曲霉毒素b2。

9、将待纯化黄曲霉毒素g1，检测波长为360nm，色谱柱为c1，流动相乙腈:水＝30:70，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的黄曲霉毒素g1；

10、将待纯化黄曲霉毒素g2，检测波长为360nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝30:70，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的黄曲霉毒素g2。

11、将待纯化赭曲霉毒素a，检测波长为330nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝50:50，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的赭曲霉毒素a。

12、将待纯化展青霉素，检测波长为280nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝15:85，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的展青霉素。

13、将待纯化玉米赤霉烯酮，检测波长为240nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝45:55，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的玉米赤霉烯酮。

14、将待纯化脱氧雪腐镰刀菌烯醇，检测波长为222nm，色谱柱为c30，流动相乙腈:水＝35:65，进行等梯度洗脱处理即获得纯度可达99％以上的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

15、上述纯化方法中对样品进行扫描采用二极管阵列检测器，采用不同的色谱柱及等度和梯度洗条件、不同样品浓度进行液相制备条件优化。

16、上述纯化过程中的原料为将各种真菌毒素固体粉末经甲醇溶解配制成不同的相应原料溶液。

17、一种所述方法的应用，所述方法纯化后的食品中真菌毒素在作为检测中的标准物质中的应用。本发明所具有的优点：

18、本发明通过优化液相色谱的条件可使制备出的毒素纯度达到99％以上，其中，毒素为黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1黄曲霉毒素g2、赭曲霉毒素a、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇，纯化所得高纯度毒素满足真菌毒素标准物质制备要求。