一种细胞因子组合物及其在抗衰老虚弱中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种细胞因子组合物及其在抗衰老虚弱中的应用。

背景技术：

1、衰老虚弱是一种复杂的老年综合症，随着年龄的增长，多种因素导致身体虚弱，包括基因组不稳定、dna损伤、表观遗传改变、干细胞衰竭等。这些相互关联的因素综合导致组织稳态的丧失和脆弱时储备能力的减少。因此，衰老的机体逐渐表现出虚弱的症状，器官的生理功能下降。由于其复杂的病理生理，需要有效的策略干预致病过程，以改善虚弱患者的健康状况。间充质干细胞（mscs）具有再生和抗炎作用。骨髓间充质干细胞移植是解决虚弱综合征病理生理问题的一种有前途的治疗策略。目前，mscs治疗已经在人类受试者中进行了i期和ii期试验，这些试验已经证实了mscs治疗衰老虚弱的有效性。干细胞主要依靠分泌的多种生长因子和细胞因子，来促进间质细胞再生和调节免疫过程和全身炎症等，来综合治疗衰老虚弱。然而现有技术中采用细胞因子来抗衰老虚弱的效果有限。

2、因此，亟需一种可以抗衰老虚弱的细胞因子组合物来进行有效作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞因子组合物，以便更好的对抗衰老虚弱进行作用。

2、为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：

3、本发明公开了一种细胞因子组合物，包括间充质干细胞液和辅料溶液；辅料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs缓冲液中得到；酪氨酸酯衍生物由酪氨酸、甲醇和月桂酰氯反应得到。酪氨酸甲酯衍生物和咖啡酸甲酯的使用，可以促进间充质干细胞液进行作用，进一步有效减缓间充质干细胞的氧化损伤和降低与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性，从而逆转间充质干细胞的衰竭，且可以有效降低cd3+总t细胞的增殖，提高免疫抑制。

4、优选地，间充质干细胞液的使用量和辅料溶液的使用量的体积比为1：0.8-1.5。

5、本发明公开了一种细胞因子组合物的制备方法，包括：

6、s1：首先将骨髓间充质干细胞接种dmem培养液中传代培养至p4-p6代，接着将p4-p6代骨髓间充质干细胞接种于无血清dmem/f12培养液中培养，培养结束后收集上清液经过微孔过滤和超滤离心得到间充质干细胞液。

7、s2：向辅料溶液中加入间充质干细胞液混合得到细胞因子组合物。

8、优选地，s1中传代培养温度为35-37℃，培养条件为4%-6% co2，传代时间为细胞长至70-85%融合后。

9、优选地，s1中无血清dmem/f12培养液培养时间为36-60h。

10、优选地，s1中超滤离心的温度为0-12℃，速度为1500-3500rpm，超滤所用超滤膜为5-10kd。

11、优选地，s2中辅料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs缓冲液中得到。

12、更优选地，酪氨酸甲酯衍生物加入pbs缓冲液的量为0.08-0.3mg/ml，咖啡酸甲酯加入pbs缓冲液的量为0.05-0.25mg/ml，表面活性素加入pbs缓冲液的量为0.009-0.017mg/ml。

13、优选地，间充质干细胞液的使用量和辅料溶液的使用量的体积比为1：0.8-1.5。

14、本发明还公开了一种细胞因子组合物在抗衰老虚弱中的应用，包括上述细胞因子组合物或上述方法制备得到的细胞因子组合物。

15、本发明公开了一种细胞因子组合物的制备方法，包括：

16、s1：间充质干细胞液的制备：将骨髓间充质干细胞接种于dmem培养液进行培养传代至p4-p6代，取p4-p6代骨髓间充质干细胞接种于无血清dmem/f12培养液中培养，培养结束后收集上清液，并经过微孔过滤和超滤离心，得到间充质干细胞液。

17、s2：细胞因子组合物的制备：向辅料溶液中加入间充质干细胞液混合得到细胞因子组合物。

18、优选地，在上述s1中，dmem培养液中含有体积分数为8-12％胎牛血清、90-110u/ml青霉素和90-110u/ml链霉素。

19、优选地，在上述s1中，传代培养温度为35-37℃，培养条件为4-6% co2，传代时间为细胞长至70-85%融合后。

20、优选地，在上述s1中，无血清dmem/f12培养液培养时间为36-60h。

21、优选地，在上述s1中，超滤离心的温度为0-12℃，速度为1500-3500rpm，超滤所用超滤膜为5-10kd。

22、优选地，在上述s2中，辅料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs缓冲液中得到。

23、更优选地，酪氨酸甲酯衍生物加入pbs缓冲液的量为0.08-0.3mg/ml.

24、更优选地，咖啡酸甲酯加入pbs缓冲液的量为0.05-0.25mg/ml。

25、更优选地，表面活性素加入pbs缓冲液的量为0.009-0.017mg/ml。

26、优选地，在上述s2中，间充质干细胞液的使用量与辅料溶液的使用量的体积比为1：0.8-1.5。

27、本发明公开了酪氨酸甲酯衍生物的制备方法，具体为：

28、将酪氨酸加入盐酸甲醇混合液中进行反应，并经过减压分离和重结晶得到酪氨酸甲酯。将月桂酰氯加入苯中得到月桂酰氯-苯溶液。然后将酪氨酸甲酯加入吡啶和苯得到溶解液，向溶解液中加入月桂酰氯-苯溶液进行反应，反应结束后静置洗涤并干燥得到粗品，粗品重结晶得到酪氨酸甲酯衍生物。

29、优选地，酪氨酸加入盐酸甲醇混合液中的量为0.1-0.2g/ml。

30、优选地，盐酸甲醇混合液中盐酸和甲醇的体积比为1：8-12。

31、优选地，月桂酰氯加入苯中的量为0.08-0.15g/ml。

32、优选地，酪氨酸甲酯的使用量为0.5-0.8g/ml。

33、优选地，溶解液中苯的使用量与吡啶的使用量的体积比为1：0.2-0.4。

34、优选地，酪氨酸甲酯的使用量与月桂酰氯的使用量的质量比为1：0.5-0.6。

35、优选地，对酪氨酸甲酯进行制备时，反应温度为55-65℃，反应时间为6-10h。

36、优选地，对酪氨酸甲酯进行制备时，使用的重结晶溶剂为75-85%乙醇，结晶次数为2-4次。

37、优选地，对酪氨酸甲酯衍生物进行制备时，反应温度为65-75℃，反应时间为3-5h，反应结束后冷却至23-27℃，继续反应0.8-1.2h。

38、更优选地，在细胞因子组合物的制备中，在使用酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素的基础上，还可以加入甘露醇六乙酸酯。甘露醇六乙酸酯可以与酪氨酸甲酯衍生物和咖啡酸甲酯相互作用，发挥协同增效作用，进而进一步降低细胞衰老，提高免疫抑制。

39、更优选地，甘露醇六乙酸酯加入pbs缓冲液中的量为0.015-0.08mg/ml。

40、本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：

41、本发明提出了一种细胞因子组合物及其在抗衰老虚弱中的应用。采用骨髓间充质干细胞经过培养，再经过过滤和超滤浓缩获得间充质干细胞液；将酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs缓冲液中得到的辅料溶液；然后间充质干细胞液和辅料溶液混合，得到细胞因子组合物。能够有效降低骨髓间充质干细胞衰老率，且可提高免疫抑制能力，在衰老虚弱方面有一定的潜力。