一种载药裸花紫珠来源细胞外囊泡及其制备方法与应用

本发明涉及药物制剂，具体涉及一种载药裸花紫珠来源细胞外囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

1、溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，uc）是一种涉及大肠或结肠的胃肠道慢性复发性炎性疾病，持续损害直肠侧结肠粘膜，通常导致糜烂和溃疡，是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，ibd）的两种主要形式之一，同时是结直肠癌最常见的病因之一。该病发病机制复杂，但确切机制尚不清楚，通常被认为是与肠道菌群紊乱、遗传易感性、环境因素、肠道上皮屏障缺陷、免疫因素及炎性介质等因素共同作用有关，同时该病病程长、易复发、迁延难愈、难以根治，且易发生癌变，是目前公认的较难治愈的病症之一。

2、uc目前主要的治疗方式为药物治疗。氨基水杨酸盐是轻中度溃疡性结肠炎的主要治疗选择，局部和全身类固醇可用于治疗溃疡性结肠炎发作，而免疫抑制剂和新型生物制剂以及不断涌出的细胞信号通路抑制剂等则用于治疗中度至重度溃疡性结肠炎。虽然常规的药物治疗可以缓解大部分uc患者的初期症状，但随着疾病的进展，患者容易出现药物耐受和大剂量的药物使用带来的副作用。因此，开发出一种能够特异性且有效地向炎症部位递送低剂量药物的制剂对uc的治疗至关重要。

3、细胞外囊泡（extracellular vesicles，evs）是由几乎所有类型细胞都能释放的纳米级脂质双层囊泡，携带了核酸、蛋白质和脂质等重要的生物分子，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等。与哺乳动物的evs相比，植物来源的evs具有相似的形态（纳米囊泡）、组成（脂质、rna和蛋白质）和功能，但其研究相对仍在起步阶段。植物evs具有作为天然纳米载体的独特的形态和组成特征，十分有潜力开发成下一代生物治疗和药物递送平台：(1) 植物evs是脂质双分子层结构，能够将亲水性药物封装在水性核心内，同时在脂质双层中容纳疏水性药物，从而改善大分子药物的不溶性和稳定性，进而提高药物的疗效；(2) 植物evs不含有人畜共患或人类病原体，几乎无毒性或免疫原性；(3) 植物evs具有内在治疗活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化等；(4)植物来源具有成本效益、环保经济，是可持续和可再生的资源；(5)植物evs有优异的细胞摄取性、胃肠道稳定性和特异性靶向能力。

4、裸花紫珠（callicarpa nudiflora hook. & arn.）是一种马鞭草科植物，中医理论认为其在消炎、解郁、抗溃疡、收敛止血、治疗烧伤和烫伤等方面存在功效，现代药理研究已证实其具有抗炎、抗血栓、神经保护、镇痛和抗氧化等活性。然而国内外对裸花紫珠的化学成分研究开展较晚，目前尚未有关于裸花紫珠来源细胞外囊泡的报道。因此可研究一种裸花紫珠来源细胞外囊泡装载uc治疗药物的方案解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种载药裸花紫珠来源细胞外囊泡及其制备方法与应用，所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡具有较高的包封率和载药率以及良好的胃肠道稳定性和生物相容性，可靶向结肠炎症部位，解决药物不溶于水的问题且提高疗效，减少全身用药引发的不良反应。

2、第一方面，本发明提供一种载药裸花紫珠来源细胞外囊泡，所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡包括裸花紫珠来源细胞外囊泡和装载于所述裸花紫珠来源细胞外囊泡内的溃疡性结肠炎治疗药物；所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡中溃疡性结肠炎治疗药物的装载量为4.39%~8.72%。

3、裸花紫珠来源细胞外囊泡作为用于治疗溃疡性结肠炎的药物递送载体时，不仅在稳定性、生物相容性以及细胞内化方面显示出优势，而且还具有内在治疗活性，能够与药物协同治疗起到抗炎和抗氧化的作用，同时靶向结肠炎症部位可降低药物的不良反应以及提高疗效，保证了药物递送的有效性和安全性。

4、可选地，所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡的粒径为100 nm~200 nm。

5、可选地，所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡的ζ电势为-30 mv~-10 mv，如此可保证载药裸花紫珠来源细胞外囊泡体系处于相对稳定的状态。

6、可选地，所述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡为双层磷脂囊泡结构，因此可将亲水性药物封装且容纳疏水性药物，起到改善大分子药物的不溶性和稳定性、提高药物疗效的效果。

7、可选地，所述溃疡性结肠炎治疗药物包括氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制药和生物制剂中至少一种。

8、可选地，所述氨基水杨酸类药物包括美沙拉嗪和柳氮磺吡啶中至少一种。

9、可选地，所述糖皮质激素包括地塞米松、布地奈德和泼尼松中至少一种。

10、可选地，所述免疫抑制药包括硫唑嘌呤和巯嘌呤中至少一种。

11、可选地，所述生物制剂包括英夫利西单抗和阿达木单抗中至少一种。

12、第二方面，本发明提供一种载药裸花紫珠来源细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

13、将裸花紫珠榨汁后过滤得滤液，滤液依次经差速离心和蔗糖密度梯度离心，得裸花紫珠来源细胞外囊泡；

14、在裸花紫珠来源细胞外囊泡上包载药物，得载药裸花紫珠来源细胞外囊泡。

15、本发明提供的制备方法可为构建其他植物来源细胞外囊泡载体平台提供参考，具有较好的创新性和开发应用前景。

16、可选地，所述差速离心包括：将滤液于4 ℃下以1,000×g离心10 min~20 min后得上清液一；将上清液一于4 ℃下以5,000×g离心20 min~40 min后得上清液二；将上清液二于4 ℃下以10,000×g离心40 min~60 min后得上清液三；将上清液三于4 ℃下以150,000×g离心1.5 h~2 h后，用2 ml~5 ml pbs溶液重悬沉淀，得裸花紫珠来源细胞外囊泡粗提液。

17、差速离心法是利用样品中各组分沉降系数的差异，对不同的微粒施以不同的离心力，多次离心中离心速度逐步加大，将不同的微粒依次沉降，从而得到大小相近的裸花紫珠来源细胞外囊泡；具体地，1,000×g、5,000×g和10,000×g的低速离心可去除滤液中裸花紫珠叶片的大颗粒杂质和细胞碎片，150,000×g的超速离心可去除滤液中的大分子蛋白质和可溶性杂质。

18、可选地，所述蔗糖密度梯度离心包括：向混合蔗糖溶液中加入裸花紫珠来源细胞外囊泡粗提液后于4 ℃下以150,000×g离心1.5 h~2 h后，得含裸花紫珠来源细胞外囊泡的条带，加入等量的pbs溶液混匀于4 ℃下以150,000×g离心1 h~1.5 h后，2 ml~5 ml pbs溶液重悬沉淀并过450 nm滤膜，得裸花紫珠来源细胞外囊泡。

19、蔗糖密度梯度离心法是利用蔗糖在不同浓度下的密度差异，使样品在混合蔗糖溶液中形成密度梯度，通过离心加速样品的沉降，使不同密度的分子在密度梯度中分层，实现分离纯化的目的，从而获得高纯度的裸花紫珠来源细胞外囊泡。

20、可选地，所述混合蔗糖溶液中包括浓度为8%、30%、45%和60%的蔗糖溶液，其中8%、30%、45%和60%蔗糖溶液的体积比为3:3:2:2。

21、可选地，所述含裸花紫珠来源细胞外囊泡的条带位于所述30%的蔗糖溶液和所述45%的蔗糖溶液的浓度梯度层之间。

22、可选地，所述在裸花紫珠来源细胞外囊泡上包载药物包括：将所述裸花紫珠来源细胞外囊泡和所述药物按投料比(20~1):1混合，于37 ℃下共孵育1 h~8 h后，55 ℃~60 ℃下搅拌30 min~60 min；其中，裸花紫珠来源细胞外囊泡和药物的投料比优选为10:1，共孵育时间优选为4 h。

23、因疏水性药物不溶于水，在裸花紫珠来源细胞外囊泡上包载药物前需将药物预先溶于乙醇中，包载后于55 ℃~60 ℃下搅拌以使溶液中的乙醇挥发，最后过450 nm滤膜以去除未包载的游离药物。

24、共孵育法是将药物装载到细胞外囊泡中最简单、最常用的方法，药物通过疏水作用、扩散或静电作用被包裹到细胞外囊泡中，也可以沿着浓度梯度载入细胞外囊泡中，其中载药效率取决于药物分子的疏水性，疏水性药物可以与囊泡膜的脂质层相互作用、提高药物的载药效率。

25、第三方面，本发明提供一种上述载药裸花紫珠来源细胞外囊泡在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

26、本发明所提供的载药裸花紫珠来源细胞外囊泡可靶向结肠炎症部位，降低药物不良反应的同时还能提高疗效，为治疗溃疡性结肠炎提供了一种新型的给药策略，有望成为临床治疗溃疡性结肠炎的一条有效策略。