一种负载外泌体的PLA生物修复材料及其制备方法与流程

本发明涉及鼓膜修复生物材料，具体涉及一种负载外泌体的pla生物修复材料及其制备方法。

背景技术：

1、鼓膜位于中耳和外耳道之间，是一层薄而柔韧的膜，其厚度小于100μm。组织学上，鼓膜由3层结构组成，外层为上皮层，由角质形成细胞组成；内层为黏膜层，由非角化黏膜上皮组成；中间层为弹力纤维层，由外呈放射状、内呈环形的胶原蛋白组成，胶原蛋白的这种特殊排列方式赋予了鼓膜听力传导的能力。掌击、碰撞、炮震、爆炸、异物刺入、外耳道冲洗和炽热异物溅入等原因均会造成鼓膜穿孔，该病为耳鼻喉科常见疾病。患者常表现为听力下降等不适，严重者甚至会影响其生活、学习和工作。

2、一般情况下鼓膜穿孔能自然愈合，患者如果3个月后仍不能够自然愈合，需要进一步手术治疗，以防止发生中耳感染、胆脂瘤等并发症。其治疗目前包括鼓膜贴片修补、局部涂药及鼓膜成形术等。目前，传统手术主要采用自体颞肌筋膜、软骨膜等作为修补材料，虽然鼓膜愈合率较高，但仍存在许多缺陷，如供体部位术后出现疼痛及手术瘢痕、手术时间过长增加麻醉风险，且选取自体材料就需二次切口，这无形中就增加了取材部位感染的机会并增加了修补失败的几乎，因此，我们急需寻找无切口、安全性高且价格适中的新型非自体材料进行替代修复。

3、组织工程材料的出现可以有效避免上述问题，组织工程材料是组织再生的支架与模板，是由在组织中具有诱导组织再生、调节细胞生长和功能分化的聚合物材料。近年来出现许多新颖的鼓膜修补材料，包括贴片、3d打印支架等，鼓膜穿孔修复主要是靠上皮细胞的扩增和迁移，鼓膜修补材料充当支架的作用，即诱导穿孔边缘的细胞向中央生长修补穿孔。目前虽有多种修补材料可供选择，但大多材料只能提供机械支撑作用，缺乏促进血管生成或细胞增殖的作用，会导致新生血管生成能力弱，和生长因子分泌不足，再加上细胞外基质的缺乏会造成细胞对新膜黏附力减弱，进一步影响鼓膜修复的效果。因此，选择合适的支架材料与生物活性物质相结合的修补材料也成为近年来新的研究方向。本发明旨在提供一种具有良好生物相容性、无排异反应，与鼓膜相似的生物力学结构和震动特性的新型生物鼓膜修复材料。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种负载外泌体的pla生物修复材料及其制备方法。所述生物修复材料以pla生物膜为支撑支架材料，并负载有可促进细胞增殖迁移的干细胞外泌体制备得到。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

5、首先本发明提供了一种负载外泌体的pla生物修复材料，所述生物修复材料是以pla为支撑支架材料，并负载有可促进细胞增殖迁移的干细胞外泌体制备得到。

6、本发明还提供了一种负载外泌体的pla生物修复材料的制备方法，所述生物修复材料按照以下步骤制备：

7、(1)制备外泌体

8、将捐赠的脂肪干细胞(adscs)(sigma)培养至p3代，待细胞传代并贴壁后使用不含血清的干细胞专用培养基(corning中国)替换完全培养基；继续培养48h后，收集细胞培养基并更换新鲜的无血清干细胞培养基；细胞培养基通过离心和过滤进行外泌体的收集；

9、具体地，细胞培养基通过离心和收集外泌体按照以下步骤：使用超速离心机在4℃下以300xg沉淀10min，然后以2000xg沉淀30min，以去除死细胞；剩余的纯化培养基以10000xg离心30min，并通过0.22μm过滤器过滤上清液，以去除多余的蛋白质；接着，将上清液以100000xg离心70min，使用pbs洗涤沉淀，并将溶液转移至新管内再次100000xg离心70min，即可得到外泌体，备用；

10、(2)制备纺丝液

11、将pla在二氯甲烷中溶解，制备成含有质量分数为2％的pla纺丝液；

12、(3)制备pla生物膜

13、将步骤(2)得到的pla纺丝液通过静电纺丝法获得pla生物膜；静电纺丝打印时，使用自制支架收集器，针与自制支架收集器之间的距离为15cm，电纺液挤出速度为1ml/h，针与自制支架收集器之间的电压为18kv，收集时间为2h；pla膜沉积在自制支架收集器上，随后得到pla生物膜，并用紫外线杀毒灭菌3h后，之后用pbs溶液清洗3遍以上，随后干燥并剪成椭圆形的pla生物膜备用；

14、(4)制备exo-pla生物修复材料

15、取甲基丙烯酸明胶(gelma)配置成质量分数为1-5％的水溶液，得到gelma水凝胶溶液，随后加入步骤(1)制备得到的外泌体，与gelma水凝胶溶液充分混合，得到含有外泌体的gelma水凝胶溶液；将上述水凝胶溶液添加到有pla生物膜的模具中，并用紫外光照射进行光固化成胶，即得exo-pla生物修复材料。

16、其中，gelma水凝胶溶液中含有0.1-0.5％的光引发剂；

17、其中，外泌体在gelma水凝胶溶液中浓度为200μg/ml-500ug/ml；优选地，外泌体在在gelma水凝胶溶液中浓度为350ug/ml。

18、(三)有益效果

19、本发明以静电纺丝技术先制备pla生物膜，并负载了具有促进细胞增殖和迁移的间充干细胞来源的外泌体，最终得到exo-pla生物修复膜材料。本发明制备的exo-pla生物修复膜材料具有较高孔径结构和较好机械强度，能够为细胞的附着、生长和增殖提供较大的表面积和较高的强度；同时具备优异的生物相容性，且能够增加细胞活性，对细胞增殖具有促进作用。

20、本发明exo-pla生物修复膜材料在治疗鼓膜穿孔大鼠14天后就能实现将穿孔尺寸减少81.27％的治疗效果，要远远高于睿膜的孔尺寸减少18.73％；在治疗鼓膜穿孔大鼠28天后，能够实现将穿孔尺寸减少97.46％的治疗效果，可实现对鼓膜穿孔大鼠的完全治愈效果。

21、本发明exo-pla生物修复膜材料能够加快鼓膜愈合的时间，提高鼓膜愈合效率，相比睿膜具有显著的治疗优势。

1.一种负载外泌体的pla生物修复材料，其特征在于，所述生物修复材料以pla生物膜为支撑支架材料，并负载有可促进细胞增殖迁移的干细胞外泌体制备得到。

2.如权利要求1所述的一种负载外泌体的pla生物修复材料的制备方法，其特征在于，所述生物修复材料按照以下步骤制备：

3.根据权利要求2所述的一种负载外泌体的pla生物修复材料的制备方法，其特征在于，gelma水凝胶溶液中含有0.1-0.5％的光引发剂。

4.根据权利要求2所述的一种负载外泌体的pla生物修复材料的制备方法，其特征在于，外泌体在gelma水凝胶溶液中浓度为200μg/ml-500ug/ml。

5.根据权利要求2所述的一种负载外泌体的pla生物修复材料的制备方法，其特征在于，外泌体在在gelma水凝胶溶液中浓度为350ug/ml。