骨类器官模型及其构建方法与应用

本发明涉及骨科类器官，特别涉及一种骨类器官模型及其构建方法与应用。

背景技术：

1、骨缺损特别是大段骨缺损是目前临床的一个重大难题。骨缺损可由肿瘤、创伤、感染等引起，是临床常见的一种创伤。现有的大型骨缺损修复方法存在明显缺陷，需要更有效的方法来增强骨再生，并加速愈合。同时，椎体压缩骨折等严重骨折也需要更有效的临床方案，以减轻病人的痛苦，避免骨水泥硬化带来的后遗症。

2、近年来，利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维培养，形成了具备一定空间结构的组织类似物，即类器官。类器官技术已在肠道、脑、肝、肾、胰等领域取得了成功，并被《自然·方法》杂志评为“年度方法”。骨类器官是以由干细胞(如骨干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等)或祖细胞定向分化而成的具有骨骼仿生空间特征的3d自组织和自我更新的微骨组织(含成骨细胞，骨细胞，破骨细胞或造血细胞单元等)，同时具有骨骼基本单元结构和功能的类器官，骨类器官也是新兴的研究骨相关疾病的重要工具。骨骼类器官构建过程中一个关键挑战是在3d组织结构中实现可相互作用的包含不同细胞类型的组织结构体系。其中有很多的难题尚未解决，比如：在体外，基于成骨细胞的细胞系分化为骨细胞的模型尚未产生可完全发育的矿化胶原基质；人类骨髓来源的间充质干细胞(hbmsc)分化为骨细胞(占骨组织细胞部分的90-95％)尚未在体外可控实现等，目前这些问题仍然是体外诱导骨骼类器官形成的关键制约步骤。mc3t3-e1细胞是小鼠颅骨胚胎成骨细胞前体细胞，具有良好的成骨分化潜能和矿化潜能，广泛用于成骨分化和矿化沉积研究。骨类器官可由祖细胞定向分化而成，其是具有3d空间特征的自组织和自我更新的组织，具有骨骼相关的基本结构和功能。因此,mc3t3-e1细胞可用于构建骨骼类器官，而且这种成骨细胞前体细胞在构建成骨分化过程中，分化步骤较少，成骨分化方向比较明确，在构建骨骼类器官临床应用方面具有显著优势，是用于设计骨骼类器官的理想细胞。

3、因此，针对现有骨科领域骨缺损填充材料不足，效果不佳，同种异体骨资源有限，排异反应，感染难题，骨组织器官不足，灭活骨组织成骨不佳，临床用于骨相关疾病研究模型不足，骨缺损尤其是大段骨缺损治疗手段局限等难题，有必要开发一种骨类器官模型。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种骨类器官模型及其构建方法与应用，可实现结构可控地，高通量，构建形态稳定的骨类器官，并可原位观察骨类器官分化发育全过程，并用于骨相关疾病研究工具与临床骨缺损相关疾病治疗等。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种用于构建骨类器官模型的培养基，所述用于构建骨类器官模型的培养基包括：

4、成骨细胞成熟培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex。

5、进一步地，所述用于构建骨类器官模型的培养基适用的起始细胞包括以下中的一种：

6、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(ipscs)；

7、骨髓间充质干细胞,各级成骨前体细胞，成骨样细胞，mc3t3-e1细胞；

8、成骨细胞，骨细胞；

9、其中，所述骨髓间充质干细胞,各级成骨前体细胞，成骨样细胞，mc3t3-e1细胞作为起始细胞用于构建骨类器官模型的培养基还包括：

10、成骨分化培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/mlasap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex、0.8-1.2μm sag、0.8-1.2μm th；

11、其中，所述胚胎干细胞、诱导多能干细胞(ipscs)作为起始细胞用于构建骨类器官模型的培养基还包括：

12、ipscs培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：800-1200单位/mllif-白血病抑制因子、0.8-1.2μm pd0325901、2-4μm chir99021；

13、中胚层诱导培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：20-40μmchir和3-7μm cyc；

14、外胚层和内胚层诱导培养基：所述外胚层和内胚层诱导培养基为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：3-7μm retinoic acid；

15、成骨分化培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/mlasap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex、0.8-1.2μm sag、0.8-1.2μm th。

16、进一步地，所述基础培养基选自dmem/f-12高糖基础培养基(11330-032,gibco)中加入神经基础培养液(21103-049,gibco)，加入n2添加剂(17502-048,gibco),加入b27添加剂(17504044,gibco)，牛血清白蛋白v(a3059,sigma-aldrich),双抗青霉素-链霉素溶液(p4458,sigma-aldrich)配制而成。

17、在本发明的第二方面，提供了一种用于构建胚胎干细胞和ipsc来源的骨类器官模型的成套添加产品，包括以下中的至少一种：

18、a、用于构建胚胎干细胞和ipsc来源的骨类器官模型的成套添加产品：

19、所述用于配制ipscs培养基的诱导分子：800-1200单位/ml lif-白血病抑制因子、0.8-1.2μm pd0325901、2-4μm chir99021；

20、所述用于配制中胚层诱导培养基的诱导分子：20-40μm chir和3-7μm cyc；

21、所述用于配制外胚层和内胚层诱导培养基：3-7μm retinoic acid；

22、所述用于配制成骨分化培养基的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex；

23、所述用于配制成骨细胞成熟培养基的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex；

24、b、用于骨髓间充质干细胞,各级成骨前体细胞，成骨样细胞，mc3t3-e1来源的骨类器官模型的成套添加产品，包括：

25、所述的成骨分化培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex、0.8-1.2μm sag、0.8-1.2μm th；

26、所述的成骨细胞成熟培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex；

27、c、用于成骨细胞，骨细胞来源骨类器官的成套添加产品，包括：

28、所述的成骨细胞成熟培养基：为在基础培养基中加入如下终浓度的诱导分子：40-60μg/ml asap、8-12mmβ-gp、0.08-0.12μm dex。

29、在本发明的第三方面，提供了一种骨类器官模型的构建方法，所述方法包括：

30、将具有微孔阵列的生物材料设于所述细胞培养板内，获得骨类器官芯片；

31、将初始干细胞悬浮在培养基中，通过细胞聚集或使用非粘附性的培养表面来促使细胞形成球状结构，获得细胞球；

32、将所述细胞球于所述骨类器官芯片中采用所述的用于构建骨类器官模型的培养基进行培养，获得骨类器官模型。

33、在本发明的第四方面，提供了采用所述方法制备得到的骨类器官模型。

34、在本发明的第五方面，提供了所述的骨类器官模型在制备用于治疗骨折、大段骨缺损、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎产品中的应用。

35、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

36、1、本发明成功完成了体外诱导ipscs和mc3t3-e1细胞的矿化过程：通过利用含诱导剂(β-gp和抗坏血酸)的培养基和无诱导剂培养基分别培养mc3t3-e1细胞，观察到实验组细胞在第21天时出现明显的矿化结节，而对照组无矿化结节形成。这表明本发明的方法能够成功诱导mc3t3-e1细胞的矿化过程。同时通过利用含诱导剂(lif-白血病抑制因子、pd0325901、chir99021)的培养基和无诱导剂的培养基进行ipscs培养，利用含诱导剂(chir、cyc)的培养基和无诱导剂培养基分进行中胚层诱导，然后利用含诱导剂(asap、β-gp、dex、sag、th)和不含诱导剂的培养基进行成骨分化培养，最后利用含有诱导剂(asap、β-gp、dex)和不含诱导剂的培养基进行成骨细胞成熟培养，观察到实验组细胞从第5天开始出现中胚层相关基因标记t，mixl1表达增加，从第19天开始出现成骨相关基因标记runx2，cola1表达增加，在这表明本发明的方法能够成功诱导ipscs细胞进行骨类器官的分化成熟过程。

37、2.为骨组织工程提供科学依据：本研究通过三维培养模拟人体内部骨骼环境，探究诱导因子和动态载荷对ipscs和mc3t3-e1成骨样细胞生物学效应的影响，为骨组织工程提供了新思路和科学依据。

38、3.深入认识人体内部骨骼环境对ipscs和mc3t3-e1样细胞生物学效应的调节机制：研究成果有望深入认识人体内部骨骼环境对ipscs和mc3t3-e1样细胞生物学效应的调节机制，有助于制定更加科学的人工骨骼模型和治疗方案，从而提高其治疗效果和临床应用价值。

39、4.探究了不同诱导因子，培养基组成以及力学强度对细胞分化的影响：通过探讨三维培养条件下细胞对不同因子强度的生物学响应，本发明为优化骨组织工程的培养策略和生物材料的设计提供了理论依据。

40、5.为其他成骨样细胞及细胞培养领域提供参考和借鉴：本研究不仅为骨组织工程提供了新的思路和科学依据，还可为其他成骨样细胞及细胞培养领域提供参考和借鉴。