一种特异性检测人血清白蛋白的荧光探针的制备及应用

本发明属于荧光探针检测及纳米载药应用，更加具体地说，涉及一种喹啉酰肼席夫碱自组装形成的纳米荧光探针在检测hsa中的应用，以及进一步用于对hsa构成的纳米颗粒进行荧光标记以实现对药物分子分布和代谢进行示踪的应用。

背景技术：

1、人血清白蛋白（hsa）是一种分子量为66.5kda的心形单链蛋白，临床上常用于治疗出血、休克、烧伤、红细胞增多、低白蛋白血症等症状。hsa可以作为生物标志物，在人类健康监测中发挥重要作用。其在血液中的正常浓度约为35-55g/l，健康个体尿液中的浓度应低于30mg/l。精确追踪疾病相关蛋白的含量和活性对于临床诊断、药物毒性监测和疾病治疗至关重要。微量白蛋白尿是糖尿病、高血压、心血管疾病和肾脏疾病的早期指标。血浆中hsa水平低，即低白蛋白血症，可能意味着肝硬化、肝功能衰竭和慢性肝炎。因此，准确检测体液中的hsa水平至关重要。

2、作为可溶性载体蛋白，hsa在血液中含量最为丰富，占血浆总蛋白含量的52%-60%。它在维持血液渗透压、运输各种物质以及结合激素、维生素、脂肪酸、钙离子和药物分子方面起着至关重要的作用。hsa作为药物载体具有优异的生物利用度。由于其在体内分布广泛、无毒、无抗原性、可生物降解，它不会在患者中引起排斥反应。同时，药物与hsa的结合可以减少药物负荷和毒性，最大限度地提高治疗效果。hsa可以与水溶性较差的药物结合，促进药物在体内的均匀分布，延缓药物代谢，延长药物疗效的循环时间。铂类药物在癌症治疗中得到了广泛而有效的应用，基于hsa的铂类药物递送系统在临床试验中显示出了良好的应用前景。研究载铂药物的hsa纳米颗粒在生物体内的代谢和分布对于药物开发、临床应用和提高患者治疗效果具有重要意义。通过将荧光探针分子与hsa结合，可以对hsa纳米载体在生物系统中进行荧光追踪。随后，随着hsa的分解，荧光分子将失去其荧光特性。因此，可以实现检测体内药物输送和代谢的目的。

3、传统的hsa检测和分析方法包括染料结合法、荧光免疫测定法、lc-ms、电泳法等。这些方法通常需要高昂的材料和仪器成本，涉及复杂的样品制备，特异性和抗干扰能力较差。小分子荧光探针已被证明是一种有前景的选择，它们具有易于制备、检测快速方便、非侵入性和在生物分子检测中的非破坏性等优点。到目前为止，已经开发了各种hsa探针，用于选择性和灵敏地检测生物样本中可能存在的hsa，但仍存在一些局限性。例如，某些hsa探针显示出较差的水溶性，这阻碍了它们在生物环境中的应用。此外，一些探针与蛋白质的氨基或巯基共价结合，导致hsa变性。大多数hsa荧光探针结合到两个经典的hsa药物结合位点，位点i和位点ii，因此体内常用的药物分子会对荧光检测造成严重干扰。开发用于定性和定量检测hsa的新型小分子探针具有巨大的实用价值和研究意义。近年来，分子自组装hsa探针已成为构建软功能材料的有力工具，在材料科学和生物学中具有广泛的应用。小分子有机染料可以在没有纳米载体的情况下直接组装成纳米粒子，表现出优异的光稳定性和生物相容性，并且在分子设计方面提供了广泛的灵活性。喹啉作为荧光团具有高荧光量子产率、大斯托克斯位移、高光稳定性、良好的生物相容性和可调荧光特性等优势；酰胺基可以增加与hsa的结合亲和力；对其进行组装设计，使酰肼席夫碱化合物的不同官能团表现出不同的亲水性和亲脂性；都有利于合成出的荧光探针作为hsa化学传感器的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的喹啉酰肼席夫碱自组装形成的纳米荧光探针，可以作为高灵敏度、高选择性的hsa荧光分析手段，和现有文献中的探针（化合物）相比较，本发明的自组装纳米荧光探针具有优异的选择性、良好的抗干扰能力、快速响应、高灵敏度、生物相容性好、稳定性强、制备简单、合成成本低等优势。喹啉酰肼席夫碱与hsa构筑的纳米颗粒，可以作为可视化的载体运载铂类药物。其优势为在光激发下可发射荧光，从而对纳米颗粒起到示踪作用。纳米颗粒解离后荧光消失，可监控铂类药物在生物体系内的释放。

2、为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

3、一种喹啉酰肼席夫碱荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构式：

4、

5、本发明进一步公开了所述喹啉酰肼席夫碱荧光探针的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

6、（1）将喹啉-2-甲酸溶解于无水乙醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流5-7 h，待反应体系冷却后，用饱和nahco3溶液调节ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层旋蒸除去溶剂，得固体喹啉-2-甲酸乙酯；

7、（2）将喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，随后在搅拌中逐滴加入水合肼，加热搅拌，冷凝回流反应1 h，tlc监测反应至喹啉-2-甲酸乙酯反应完全停止反应；待反应液冷却至室温后，真空减压浓缩，加入甲醇、乙醇循环交替旋蒸至反应体系中水合肼被蒸发除去，得到喹啉-2-甲酰肼，其中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼的物质的量之比为1:15-30；

8、（3）将喹啉-2-甲酰肼溶解于无水甲醇中，另将2，4-二羟基苯甲醛溶解于无水甲醇，在搅拌下缓缓滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加热搅拌，冷凝回流反应9.5 h，将反应液冷却至室温后，抽滤并洗涤沉淀，真空干燥得反应产物即该喹啉酰肼席夫碱荧光探针；其中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羟基苯甲醛的投料物质的量比为1:1。

9、本发明更进一步公开了所述喹啉酰肼席夫碱荧光探针在用于hsa定性和定量检测中的应用，其特征在于喹啉酰肼席夫碱荧光探针在pbs缓冲液中形成自组装纳米荧光探针；pbs缓冲液的ph = 7-8。将hsa加入到所述探针溶液中，在365 nm 紫外灯下，溶液由无色变为青色，实现对hsa的快速检测。另外在370-420 nm激发光下，本身几乎没有荧光信号，与hsa作用后，在495 nm处产生很强的青色荧光信号，且对hsa的定量检测浓度范围为0-8 mm，检测限为8.49 nm。实验结果显示：喹啉酰肼席夫碱荧光探针对于hsa具有良好的检测能力，灵敏性高，荧光强度与浓度具有良好的线性关系，可准确的定量测量hsa浓度。

10、本发明也公开了喹啉酰肼席夫碱荧光探针在用于检测活细胞和生物样品中hsa方面的应用。主要是喹啉酰肼席夫碱荧光探针与hsa形成纳米颗粒，用于检测氯代血红素。实验结果显示：荧光探针与hsa形成的纳米颗粒可定量检测氯代血红素，检测限低，灵敏性好。

11、本发明还公开了喹啉酰肼席夫碱荧光探针与hsa形成荧光示踪的纳米颗粒，在用于运载铂类药物中的应用。其合成方法按如下反应制备：

12、将1 mm，hsa水溶液加入pbs缓冲液中，在高速搅拌下用移液管枪将1 mm探针分子的dmf溶液缓慢加入hsa溶液中，将上述溶液装入已煮沸并活化过滤的透析袋中，用pbs缓冲液透析2小时，以从系统中去除单分子和小颗粒；然后用移液器从透析袋中提取样品，并用少量pbs缓冲液冲洗袋内，确保样品的完全转移，所得溶液密封在冰箱中4°c保持。实验结果显示：荧光探针与hsa形成的纳米颗粒具有良好的荧光性能，可稳定的运载铂类药物，纳米颗粒解离后荧光消失，可实现对药物载体的监控。

13、本发明更加详细的内容如下

14、本发明作为hsa检测和铂类药物的荧光示踪载体的应用通过下述技术方案予以实现：

15、用于hsa检测的喹啉酰肼席夫碱自组装形成的纳米荧光探针，具有如下所示的结构式：

16、

17、所述喹啉酰肼席夫碱形成的自组装纳米荧光探针用于对hsa的定性和定量检测方面的应用。

18、所述喹啉酰肼席夫碱形成的自组装纳米荧光探针的合成具体如下：

19、（1）将喹啉-2-甲酸溶解于无水乙醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流5-7 h，待反应体系冷却后，用饱和nahco3溶液调节ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层旋蒸除去溶剂，得到喹啉-2-甲酸乙酯。

20、（2）将喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，随后在搅拌中逐滴加入水合肼（n2h4·h2o），加热搅拌，冷凝回流反应1 h。tlc监测反应至喹啉-2-甲酸乙酯反应完全（石油醚：乙酸乙酯= 5：1），停止反应。待反应液冷却至室温后，真空减压浓缩，加入甲醇、乙醇循环交替旋蒸至反应体系中水合肼被蒸发除去，得到喹啉-2-甲酰肼。

21、所述（2）中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼投料的物质的量之比为1:(15-30)。

22、（3）将喹啉-2-甲酰肼溶解于无水甲醇中，另将2，4-二羟基苯甲醛溶解于甲醇，在搅拌下缓缓滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加热搅拌，冷凝回流反应9.5 h。将反应液冷却至室温后，抽滤并洗涤沉淀，真空干燥得反应产物即该喹啉酰肼席夫碱荧光探针。

23、所述（3）中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羟基苯甲醛的投料物质的量比为1:1。

24、所述的合成路线如下：

25、

26、所述喹啉酰肼席夫碱在pbs缓冲液中形成自组装纳米荧光探针。

27、所述pbs缓冲液的ph = 7-8。

28、所述喹啉酰肼席夫碱自组装形成的纳米荧光探针，在激发波长范围为370-420 nm激发下，探针本身几乎没有荧光信号，与hsa作用后，在495 nm处产生很强的荧光信号，且对hsa的定量检测浓度范围为0-8 mm，检测限为8.49 nm。

29、所述喹啉酰肼席夫碱自组装形成的纳米荧光探针，激发波长范围是370-420 nm，发射波长约为495 nm，与hsa的结合位点为fa1位点，有效的克服了水溶性差和常见药物分子的干扰等缺点，对hsa有很好的选择性，可以用于生物体系中hsa的检测。