一种头孢菌素C酰化酶突变体

本发明属于生物催化，涉及头孢菌素c酰化酶突变体及及其用于一步酶法生产7-氨基头孢烷酸的应用。

背景技术：

1、头孢类抗生素作为广泛使用的β-内酰胺类抗生素，约占全球市场的40％。其关键中间体7-氨基头孢烷酸(7-aca)的制备，主要依赖于化学合成法和生物酶法。早期生产多采用化学合成法，但由于其工艺复杂、能耗高且产生大量污染物，逐渐被更为环保的生物酶法所取代。生物酶法分为两步酶法和一步酶法。两步酶法首先利用d-氨基酸氧化酶(daao)将头孢菌素c(cpc)转化为戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(gl-7-aca)，随后通过酰化酶将其转化为7-aca。然而，该工艺成本较高，且副产物过氧化氢(h2o2)对cpc有降解作用，增加了生产的复杂性。

2、为了简化工艺并降低成本，开发了一步酶法，直接利用cpc酰化酶将cpc转化为7-aca。近年来，一些基因工程研究已尝试提高cpc酰化酶对cpc的酶活性，通过对pseudomonassp.se83来源的cpc酰化酶进行改造，获得了酶活性比野生型酶高出几十倍的突变体，但此类酶仍存在较强的7-aca产物抑制性，无法满足工业生产的要求。pseudomonas sp.gk16来源的cpc酰化酶突变体i215v/f228v/v240f/a306t/y323t/f347l/v552l/r553l/h623t(cn105543201b)，在水解cpc生成7-aca的活性上相较野生型酶提高了150倍，同时提高了底物特异性且降低了产物抑制性。此外，pseudomonas sp.p130来源的cpc酰化酶突变体130-ed2：g25d/i215v/f228v/v240f/y323t/f347l/h623t(cn 109072215 b)相比野生型酶提高了54倍，并在此基础上进一步开发了突变体130-v34，酶活性比130-ed2提高了2.9倍，同时改善了酶的稳定性(cn 111172142 b)。

3、根据cn 117247925 a的描述，发明人通过对bosea sp.ok403来源的cpc酰化酶进行基因工程改造，开发了一系列具有更高酶活性的突变体，显著提升了其对头孢菌素c钠盐的催化效率。然而，为了满足工业生产的高标准，仍需进一步提高酶的活性。因此，本发明致力于开发一种酶活性更高的cpc酰化酶突变体，以在工业生产中展现更大的应用潜力。

技术实现思路

1、为了提高cpc酰化酶的酶活性，本发明通过理性设计和定向进化等技术对现有的cpc酰化酶进行改造和筛选，构建高酶活性的cpc酰化酶突变体。

2、通过定点突变技术继续对cn 117247925 a中的l159s/a419v突变体(氨基酸序列如se q id no：1所示)进行改造，获得以cpc作为底物的高酶活的cpc酰化酶突变体。具体而言，本发明包括如下技术方案。

3、一种头孢菌素c酰化酶(cpc酰化酶)突变体，其在seq id no:1所示氨基酸序列上第g160、l161、l162、g164、w167、w171、l174、s238、d258、p259、h260、v262、t306、h307、f309、i312、l376、h415、p603、l707位进行替换突变得到的蛋白质。

4、所述突变头孢菌素c酰化酶进行的选自以上20个位点中任一位点突变为半胱氨酸或甲硫氨酸得到的蛋白质：

5、(1)g160为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

6、(2)l161为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

7、(3)l162为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

8、(4)g164为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

9、(5)w167为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

10、(6)w171为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

11、(7)l174为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

12、(8)s238为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

13、(9)d258为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

14、(10)p259为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

15、(11)h260为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

16、(12)v262为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

17、(13)t306为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

18、(14)h307为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

19、(15)f309为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

20、(16)i312为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

21、(17)l376为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

22、(18)h415为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

23、(19)p603为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

24、(20)l707为半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

25、在一种实施方式中，上述改变是指第171位w替换为m(即w171m)、第174位l替换为m(即l174m)、第312位i替换为c(即i312c)、第707位l替换为c(即l707c)。

26、本发明的第二个方面在于提供编码上述cpc酰化酶突变体的基因。

27、本发明的第三个方面在于提供包含上述基因的质粒。该质粒是pet系列载体，比如载体是pet-28a，但并不受限于此。

28、本发明的第四个方面在于提供表达上述编码基因的微生物，其转化了上述编码基因或质粒。

29、优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、顶头孢霉、产黄青霉，优选大肠杆菌、顶头孢霉，更优选大肠杆菌bl21(de3)。

30、本发明的第五个方面在于提供上述cpc酰化酶突变体或微生物在制备7-aca中的用途。

31、上述头孢菌素c酰化酶突变体或者微生物可以用于生产7-aca尤其是以头孢菌素c(即cpc)为底物原料，用上述头孢菌素c酰化酶突变体或者微生物作为催化剂来催化的一步酶法生产7-aca的反应。

32、生产7-aca可采用常规的工艺条件，比如，反应温度可选择20～40℃，优选25℃；磷酸缓冲液ph可选6.5～9.5，优选8.0；头孢菌素c的浓度可选择5～80mm，优选20mm。

33、相较于seq id no:1所示氨基酸序列的初始酶，本发明的cpc酰化酶突变体的酶活性明显提高，酶活力最高提升了2.4-3倍。

1.一种头孢菌素c酰化酶突变体，其特征在于：其在seq id no：1所示氨基酸序列中的g160、l161、l162、g164、w167、w171、l174、s238、d258、p259、h260、v262、t306、h307、f309、i312、l376、h415、p603、l707中的一个或多个位点存在替换突变。

2.根据权利要求1所述头孢菌素c酰化酶突变体，其特征在于：所述替换突变是用半胱氨酸或甲硫氨酸进行替换；其是如下任意之一的替换突变：

3.根据权利要求1或2任一项所述的头孢菌素c酰化酶突变体的编码基因。

4.含有如权利要求3所述的编码基因的重组载体。

5.含有如权利要求3所述的编码基因或如权利要求4所述重组载体的重组菌株。

6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，其出发菌是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、顶头孢霉、产黄青霉，优选大肠杆菌、顶头孢霉，更优选为其为e.colibl21(de3)。

7.如权利要求1或2所述的头孢菌素c酰化酶突变体、权利要求3所述的编码基因、权利要求4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的重组菌株在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。

8.一种制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于，以头孢菌素c为底物、用如权利要求1或2任一项所述的头孢菌素c酰化酶突变体或如权利要求5或6所述的重组菌株催化生成7-氨基头孢烷酸。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用权利要求1或2所述头孢菌素c酰化酶突变体的纯酶或全细胞的形式催化制备7-aca。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：头孢菌素c突变体的浓度可选择5~80 mm，优选20mm；磷酸缓冲液ph可选6.5~9.5，优选8.0；