一种非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物及其应用与构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法

本发明涉及生物医学，更具体的说是涉及一种非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物及其应用与构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法。

背景技术：

1、酒精性脂肪肝（nafld）的发病率在全球范围内呈上升趋势，且不同地区和人群的患病率存在差异。在发达国家和地区，如欧美，其患病率较高；而在发展中国家，随着生活方式的改变和肥胖症的流行，患病率也在逐渐增加。非酒精性脂肪肝（nafld）可见于各个年龄段，但在中年人群中更为常见，且男性的患病率略高于女性。目前的诊断主要依赖于影像学检查（如超声、磁共振成像等）和血液生化指标（如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血脂等），但这些方法在疾病早期的敏感性和特异性不够高；肝活检虽然是诊断的金标准，但它是一种有创性检查，存在一定的风险，且患者接受度较低。

2、研究发现，非酒精性脂肪肝患者的肠道微生物多样性可能降低，某些有益菌的数量减少，而有害菌或条件致病菌的数量增加；特定的肠道微生物种类、菌群比例或其代谢产物有望成为非酒精性脂肪肝的新型诊断标志物。本发明旨在通过宏基因组测序技术识别酒精性脂肪肝患者与正常人群粪便样品中的差异微生物群落，并利用随机森林模型对这些差异微生物进行验证，以期发现新的生物标志物或治疗靶点，提高nafld的早期诊断率及治疗效果。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物及其应用与构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，通过分析非酒精性脂肪肝患者的肠道微生物的组成和功能变化，更早地发现非酒精性脂肪肝的病情，并监测治疗效果。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物，所述肠道微生物标志物包括以下菌种：actinomyces_dentalis、长双歧杆菌（bifidobacterium_longum）、faecalibacillus_intestinalis、anaerobutyricum_hallii、经黏液真杆菌属（blautia_wexlerae）、anaerostipes_hadrus、假小链双歧杆菌（bifidobacterium_pseudocatenulatum)、dorea_longicatena。

4、进一步地，所述应用包括用于诊断患者是否患有非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝的产品、作为靶点用于非酒精性脂肪肝的病情评估和治疗以及构建非酒精性脂肪肝检测模型；所述产品包括检测试剂、检测试剂盒和检测芯片中的任意一种。

5、本发明还提供了一种利用非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，包括以下步骤：

6、（1）分别提取非酒精性脂肪肝患者和健康人群的粪便中总dna，预处理后进行测序，对测序结果进行宏基因组组装、基因预测及基因集构建、物种组成及丰度、基因功能分析、多样性分析以及多样品比较分析，筛选出非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物；

7、（2）通过非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物建立鉴定非酒精性脂肪肝和健康人群样本的随机森林模型，评估，得到非酒精性脂肪肝检测模型；

8、（3）将待测患者的宏基因组及其丰度信息输入非酒精性脂肪肝检测模型进行识别。

9、进一步地，所述步骤（1）中，所述预处理，包括：文库制备，所述文库制备具体为：

10、随机打断成特定长度的片段，对片段化后的dna末端进行修复，将修复后的dna片段两端连接特定接头序列，并去除多余接头、引物，对特定接头序列进行pcr扩增。

11、进一步地，所述步骤（1）中，所述进行测序，包括：用fastp进行去除接头、用bowtie2去除宿主序列、用metaphlan4进行基于marker的物种丰度分析、用humann33进行功能分析。

12、进一步地，所述步骤（2）中，通过非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物建立鉴定非酒精性脂肪肝和健康人群样本的随机森林模型，评估，得到非酒精性脂肪肝检测模型，具体为：

13、将非酒精性脂肪肝患者和健康人群分为训练集和测试集，利用python中的sklearn.ensemble.randomforestclassifier模块对所述训练集进行随机森林模型训练；

14、所述评估的方法为：通过绘制学习曲线评估随机森林模型的拟合程度，并通过十折交叉验证对随机森林模型进行验证。

15、进一步地，所述步骤（2）中随机森林模型的训练参数为：梯度n_estimators={100,500, 1000}，max_depth={1, 2, 3, 7, 9}，max_features=["log2", "sqrt"]，使用python软件gridsearchcv模块搜索最佳参数，使用最佳参数重新构建随机森林模型，并在测试集上进行预测。

16、根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：

17、（1）本发明从宏基因组数据中提取与非酒精性脂肪肝发病机制和进程相关的生物标志物；采用随机森林算法来构建非酒精性脂肪肝检测模型，可以增加模型的泛化能力和抗过拟合性，还能够更准确地预测和评估糖尿病的病情，这有助于医生制定更有效的治疗方案，提高患者的生存率和生活质量。

18、（2）本发明通过随机森林模型和10折交叉验证的五次试验得到误差曲线cverror，可以更准确地识别出非酒精性脂肪肝患者和健康对照的差异菌，从而提高非酒精性脂肪肝的早期辅助诊断的准确性，还通过roc曲线和marker菌，可以对非酒精性脂肪肝患者进行个性化的治疗，提高治疗效果。本发明的模型被验证并应用于临床，可以减少昂贵的医疗测试和不必要的医疗干预，从而节省医疗资源。

19、（3）本发明提出了一种利用随机森林模型等方法来识别非酒精性脂肪肝的特异性肠道微生物标志物的技术方案，可以用来揭示与非酒精性脂肪肝相关的宿主-微生物代谢途径的变化，可能有助于发现新的生物标志物，可能发现新的生物标志物或治疗靶点。

1.一种非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物，其特征在于，所述肠道微生物标志物包括以下菌种：actinomyces_dentalis、长双歧杆菌（bifidobacterium_longum）、faecalibacillus_intestinalis、anaerobutyricum_hallii、经黏液真杆菌属（blautia_wexlerae）、anaerostipes_hadrus、假小链双歧杆菌（bifidobacterium_pseudocatenulatum)、dorea_longicatena。

2.一种权利要求1所述的非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物的应用，其特征在于，所述应用包括用于诊断患者是否患有非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝的产品、作为靶点用于非酒精性脂肪肝的病情评估和治疗以及构建非酒精性脂肪肝检测模型；所述产品包括检测试剂、检测试剂盒和检测芯片中的任意一种。

3.一种应用权利要求1所述的非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述预处理，包括：文库制备，所述文库制备具体为：

5.根据权利要求3所述的构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述进行测序，包括：用fastp进行去除接头、用bowtie2去除宿主序列、用metaphlan4进行基于marker的物种丰度分析、用humann33进行功能分析。

6.根据权利要求3所述的构建非酒精性脂肪肝检测模型的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，通过非酒精性脂肪肝肠道微生物标志物建立鉴定非酒精性脂肪肝和健康人群样本的随机森林模型，评估，得到非酒精性脂肪肝检测模型，具体为：

7.根据权利要求6所述的构建克罗恩病检测模型的方法，其特征在于，所述步骤（2）中随机森林模型的训练参数为：梯度n_estimators={100, 500, 1000}，max_depth={1, 2,3, 7, 9}，max_features=["log2", "sqrt"]，使用python软件gridsearchcv模块搜索最佳参数，使用最佳参数重新构建随机森林模型，并在测试集上进行预测。