miR-378a-5p在促进初始化CD4+T细胞向Th1方向分化中的应用

本发明关于生物，尤其涉及mir-378a-5p在促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化中的应用。

背景技术：

1、棘球蚴病，又称包虫病，是由棘球绦虫的幼虫寄生在宿主体内而引发的一种人畜共患寄生虫病，主要发生在畜牧业发达的国家和地区。当棘球蚴感染宿主后，宿主将产生非常复杂的免疫应答，包括体液免疫、细胞免疫及补体介导的免疫反应。其中，cd4+t细胞在棘球蚴与宿主的相互关系中发挥着重要的作用。在早期预防的研究中，基因工程疫苗的研究备受关注。

2、非编码rna(ncrna)的发现对基因表达调控的研究产生了重大影响。虽然其缺乏蛋白质编码能力，但它们可以调节基因表达和蛋白质功能，参与各种生物学机制，包括生长、迁移、自噬、细胞凋亡和分化等。其中microrna是细胞内广泛表达的一类长度为22个核苷酸左右的单链非编码小rna分子，主要通过与其靶基因的3ˊ非翻译区发生特异性的相互作用降解靶mrna或抑制其翻译，从而阻断靶蛋白质的形成，进而发挥其调控作用。近年来，越来越多的研究揭示了mirna参与多种疾病的发展，其中包括不同类型的癌症、心脏病(如肥大和缺血)以及与精神障碍(如精神分裂症或重度抑郁症)相关联的疾病。研究发现，寄生虫感染同样可以引起宿主mirna的变化，进而调控一系列宿主基因的表达，从而逃避宿主免疫防御。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供mir-378a-5p在促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化中的应用。本发明通过研究发现了mir-378a-5p能通过调节其靶基因braf进而影响初始化cd4+t细胞的分化，为棘球蚴病的预防与治疗提供了新的线索和理论依据。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、本发明第一方面提供mir-378a-5p在促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化中的应用。

4、本发明通过研究发现，细粒棘球绦虫重组蛋白p29(reg.p29)对小鼠和绵羊的抗包虫免疫保护力分别为96.6％和94.5％。reg.p29可同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，reg.p29免疫可诱导高水平的抗reg.p29特异性抗体，抗体反应在加强免疫后第2周达到峰值，并维持超过16周，同时，reg.p29可通过促进初始cd4+t细胞向th1方向分化，产生大量ifn-γ等细胞因子清除病原体。本发明以reg.p29为切入点，构建小鼠的包虫感染模型和reg.p29免疫模型，采用二代测序技术，筛选出了reg.p29免疫前后以及包虫感染前后小鼠免疫细胞中差异表达的microrna分子。测序结果显示，与包虫阳性感染组相比，具有较高保护力的reg.p29免疫组mmu-mir-378a-5p表达水平显著升高。本发明利用靶基因预测网站预测了mir-378a-5p可能调控的靶基因，双荧光素酶报告基因证实其靶基因为braf。通过qrt-pcr、western blot和流式细胞术实验验证，mir-378a-5p通过调节braf进而影响初始化cd4+t细胞的分化，进一步确定mir-378a-5p能够促进小鼠脾脏初始化cd4+t细胞向th1方向分化，抑制其向th2方向分化。

5、为了验证mir-378a-5p靶基因braf对初始化cd4+t细胞分化的影响，本发明还合成了靶基因braf的干扰小片段sirna-braf-1341，在初始化cd4+t细胞中转染该干扰小片段后，qrt-pcr、western blot和流式细胞术的检测结果显示th1型细胞因子ifn-γ表达明显上升，而th2型细胞因子il-4明显下降，而转染braf过表达慢病毒后则得到了相反的结果，说明braf抑制小鼠脾脏初始cd4+t细胞向th1方向分化，促进其向th2方向分化。

6、为了验证mir-378a-5p靶基因braf功能恢复，本发明在小鼠脾脏初始化cd4+t细胞中共同转染mir-378a-5p和braf后通过qrt-pcr和流式细胞术检测th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达情况。结果发现mir-378a-5p引起的促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化能够被braf恢复。

7、由于实验设计到脾脏细胞，人体实验无法进行，因此本实验在小鼠脾脏细胞中验证。mir-378a-5p的成熟体序列在鼠和人体中是一致的，因此本发明为临床探讨包虫感染病人体内免疫机制的变化提供了新的思路和方向，为棘球蚴病的诊断与防治提供了新的线索和理论依据。

8、结合第一方面，所述mir-378a-5p的核苷酸序列为cuccugacuccagguccugugu(如seq id no:1所示)。

9、本发明第二方面提供mir-378a-5p模拟物在制备棘球蚴病预防或治疗药物中的应用。由于mir-378a-5p模拟物能够提高mir-378a-5p在细胞中的表达量，而mir-378a-5p能够促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化，激活细胞免疫应答，从而发挥控制包虫早期形成、生长、转移和抗感染的作用，因此mir-378a-5p模拟物可用于棘球蚴病预防或治疗药物的制备。

10、结合第二方面，所述mir-378a-5p模拟物为双链：

11、正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu(如seq id no:2所示)；

12、反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu(如seq id no:3所示)。

13、本发明第三方面提供一种预防棘球蚴病的药物，其活性成分包括mir-378a-5p模拟物。

14、结合第三方面，所述mir-378a-5p模拟物为双链：

15、正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu；

16、反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu。

17、结合第三方面，所述药物的剂型为注射剂。

18、本发明第三方面提供一种治疗棘球蚴病的药物，其活性成分包括mir-378a-5p模拟物。

19、结合第四方面，所述mir-378a-5p模拟物为双链：

20、正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu；

21、反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu。

22、结合第四方面，所述药物的剂型为注射剂。

23、本发明的有益效果在于：初始化cd4+t细胞的分化对于宿主抵御外来病原体有很大作用，对于棘球蚴病的预防和治疗具有重要意义。本发明初次证实mir-378a-5p和braf在小鼠脾脏初始化cd4+t细胞分化过程中的作用以及mir-378a-5p和braf之间的靶向关系，并且通过挽救实验证明了靶基因braf可以恢复由mir-378a-5p引起的细胞分化，由此证明mir-378a-5p在小鼠脾脏初始化cd4+t细胞分化过程中的作用。本发明为棘球蚴病的预防与治疗提供了新的线索和理论依据。

1.mir-378a-5p在促进初始化cd4+t细胞向th1方向分化中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-378a-5p的核苷酸序列为cuccugacuccagguccugugu。

3.mir-378a-5p模拟物在制备棘球蚴病预防或治疗药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述mir-378a-5p模拟物为双链：正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu，反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu。

5.一种预防棘球蚴病的药物，其特征在于，其活性成分包括mir-378a-5p模拟物。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述mir-378a-5p模拟物为双链：正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu，反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu。

7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

8.一种治疗棘球蚴病的药物，其特征在于，其活性成分包括mir-378a-5p模拟物。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述mir-378a-5p模拟物为双链：正义链序列为：cuccugacuccagguccugugu，反义链序列为：acaggaccuggagucaggaguu。

10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。