嵌合启动子及其用途的制作方法

本发明涉及一种嵌合启动子及其用途，特别是涉及一种由三个彼此异源的dna分子嵌合构成的新型组成型启动子及其用途。

背景技术：

1、植物的地下根系部分对植物的代谢及吸收起着不可或缺的作用，可对来自土壤中的水分、无机盐进行吸收利用，为植物的生长发育和结实提供支持。植物籽粒是决定产量和品质的关键因素之一。但自然环境中的一些生物和非生物胁迫对植物根部和籽粒的生长产生了较大的威胁，如土传病害、地下害虫和刺吸性害虫，其严重影响了一些重要粮食和经济作物的产量。因此，植物根部和籽粒是育种遗传改良的重要目标。

2、为抵御植物的生物和非生物胁迫威胁，转基因技术的应用显得尤为重要。转基因技术可将外源dna序列连接到特定的启动子从而启动外源dna序列在植物宿主中表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。例如，组成型启动子可对整个植物组织进行组成型表达，组织特异性启动子仅在植物特定组织中表达基因，诱导型启动子可在某些物理或化学信号的刺激下提高基因表达水平。目前农业生物技术领域应用较多的启动子为组成型启动子以及对现有组成型启动子进行修饰后得到的嵌合启动子，然而在利用嵌合启动子启动目的基因转化作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因在植物某些重要细胞类型(例如植物根部和籽粒)中表达量不足而导致改良效果不明显。

3、鉴于此，本发明提供了新型嵌合启动子，所述嵌合启动子可在植物中启动目的基因组成型表达且在植物根部和籽粒中表现出较高的表达水平。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新颖的嵌合启动子及其用途，所述嵌合启动子可在植物中启动目的基因组成型表达且在植物根部和籽粒中表现出较高的表达水平。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种嵌合启动子，所述嵌合启动子的核苷酸序列包括：(1)与seq id no:1所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；或(2)具有seq id no:1所示的核苷酸序列。

3、为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，其包含与目的异源核苷酸序列有效连接的所述嵌合启动子。

4、为实现上述目的，本发明还提供了一种dna构建体，其包含所述表达盒。

5、为实现上述目的，本发明还提供了一种或重组载体，其包含所述dna构建体。

6、为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，包括：将所述表达盒或所述dna构建体稳定的整合进植物细胞中，使得所述目的异源核苷酸序列在所述植物中表达。

7、优选地，所述目的异源核苷酸序列编码非生物应激抗性蛋白质或生物应激抗性蛋白质。

8、进一步地，所述非生物应激抗性蛋白质为除草剂耐受性蛋白质。所述生物应激抗性蛋白质为昆虫抗性蛋白质。

9、为实现上述目的，本发明还提供了一种所述嵌合启动子用于在植物组织中组成型表达目的异源核苷酸序列的用途。

10、进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

11、在上述技术方案的基础上，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。进一步优选地，所述双子叶植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、芹菜、棉花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫芦、萝卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、拟南芥、花生或西瓜；优选地，所述双子叶植物是指黄瓜、大豆、拟南芥、烟草、棉花、花生或油菜。所述单子叶植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、粟、甘蔗、燕麦或草坪草；优选地，所述单子叶植物是指玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、粟、甘蔗或燕麦。

12、提供以下描述和定义是为了更好地限定本发明以及指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另有说明，术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

13、本发明中术语“核酸(序列)”或“dna分子”是指基因组或合成来源的双链dna分子，即从5’(上游)末端读取到3’(下游)末端的脱氧核苷酸碱基的聚合物或dna分子。术语“dna序列”是指dna分子的核苷酸序列。

14、本发明中术语“启动子”通常是指参与识别和结合rna聚合酶ii和其他蛋白质(诸如反式作用转录因子)以启动转录的dna分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5′utr)中分离。可替代地，启动子可以是合成产生的或操纵的dna分子。启动子可以是嵌合的。

15、本发明中术语“嵌合”是指通过将第一dna分子融合至第二dna分子而产生的单个dna分子，其中无论所述第一dna分子还是所述第二dna分子通常都不会以所述构型存在，即彼此融合。因此，嵌合dna分子是通常不以其他方式存在于自然界中的新的dna分子。术语“嵌合启动子”是指通过两个或更多个异源dna分子的融合产生的新的启动子，例如通过在具有其自身部分或完全调节序列的活性启动子上添加异源调节序列，也可以通过在无活性的截短启动子的5’上游区添加异源调节序列，发展出嵌合启动子，所述无活性的截短启动子即仅包括核心tata并任选包括ccaat元件的启动子。

16、本发明中术语“组成型启动子”是指在该类启动子的控制下，目的异源核苷酸序列的表达大体恒定在一定水平上，在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段表达水平没有明显差异。所述组织为植物体中由来源相同和执行同一功能的一种或多种类型细胞集合而成的结构单位，例如保护组织、输导组织、营养组织、机械组织、分生组织，几种不同的组织有机配合、紧密联系，形成不同的器官，不同的器官之间互相配合，更有效地完成有机体的整个生命活动过程。所述生长发育阶段可根据植物形态、机能的差异划分为胚胎阶段、幼苗阶段、成熟阶段和衰老阶段。本发明中术语“组成型表达”是指目的异源核苷酸序列在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段都以大体上一致的水平进行表达。

17、本发明中，“序列同一性”指两个最佳比对的dna或氨基酸序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的比对窗口整个范围内不变的程度。测试序列和参考序列(本发明seq id no:1)的已比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即完整的参考序列或参考序列的更小限定的部分)中组分的总数目。“同一性％”是同一性分数乘以100。例如可从美国国立生物技术信息中心(national center forbiotechnology information；www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的blast运算法则，使用默认参数确定。

18、本发明中术语“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。本发明中所述“有效连接”可以为将本发明所述嵌合启动子与感兴趣的目的异源核苷酸序列相连，使得该感兴趣的目的异源核苷酸序列的转录受到该嵌合启动子控制和调控。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供dna转移和/或整合功能的序列(即t-dna边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

19、本发明中术语“重组”是指由基因工程引起并且通常不存在于自然界中的非天然发生的dna、蛋白质、细胞、种子或生物体。“重组dna分子”是指包含在自然界中非天然地发生并且由人类干预产生的dna分子，如由彼此异源的至少两个dna分子构成的dna分子。其中，“基因工程”是指创造通常不存在于自然界中并且需要施加人类干预的非天然dna、蛋白质或生物体。基因工程可用于使用生物技术，如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化、以及植物转化中的一种或多种技术以构思并创造的工程dna、蛋白质或生物体。

20、“除草剂耐受性”或“耐受性”是指完全或部分不受一种或多种除草剂的存在或施用影响的能力，例如当施用时抵抗除草剂的毒性作用的能力。如果细胞、种子或植物在一种或多种除草剂的存在下能够维持至少一些正常的生长或表型，则所述细胞、种子或植物是“除草剂耐受的”或具有“改善的耐受性”。如果与野生型或对照细胞、植物或种子相比，性状的存在可以赋予细胞、植物或种子对除草剂的改善的耐受性，则所述性状是除草剂耐受性性状。包含除草剂耐受性性状的作物可以继续生长，并且受除草剂的存在的影响最小。如果与野生型或对照细胞、植物或种子相比，蛋白质的表达可以赋予细胞、植物或种子对除草剂的改善的耐受性，则所述蛋白质赋予了“除草剂耐受性”。“除草剂耐受性蛋白质”包括但不限于乙酰乳酸合酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶、羟基苯丙酮酸双加氧酶、草胺磷乙酰转移酶、原卟啉原氧化酶、草甘膦氧化还原酶。除草剂耐受性可以是对特定除草剂的完全或部分不敏感性，并且可以表示为对特定除草剂的耐受性或不敏感性百分比(％)。

21、“昆虫抗性蛋白质”可以抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生长、摄食、繁殖力或存活力)、控制(控制害虫侵扰、控制含有有效剂量的杀虫蛋白质在特定作物上的害虫摄食活动)或杀死(引起发病、死亡或降低繁殖力)害虫。对害虫提供有效剂量的杀虫蛋白质，使所述害虫暴露于所述杀虫蛋白质以导致发病、死亡、繁殖力降低或发育迟缓。“昆虫抗性蛋白质”还包括由于在植物中或在植物上提供有效剂量的杀虫蛋白质而将害虫从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或从植物可能生长的特定地理位置中驱离。杀虫蛋白质可由植物产生，或可被施加于植物或植物所位于的位置内的环境。

22、术语“基因”是指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域)控制下在细胞内含有被转录成rna分子(例如mrna)的dna区域(“转录的dna区域”)的任何dna片段。因此，基因可能含有几种有效连接的dna片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的dna区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。

23、术语“天然”指天然出现的(“野生型”)核酸序列。

24、术语“异源”序列指源自外来来源或物种的序列，或者当来自同一来源时指由其原始形式受到修饰的序列。

25、本发明中术语“dna构建体”是包含两个或更多个异源的dna序列的重组dna分子。dna构建体可用于转基因表达并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可用于载体中以用于转化的目的，即将异源dna引入到宿主细胞中，以产生转基因细胞和植物，并且还可包含在转基因细胞、植物或其部分、种子的质粒dna或基因组dna中。“植物转化载体”典型地含有包含t-dna转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、经工程改造成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和目的基因，此质粒载体上也存在细菌复制所需的序列，将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。如本领域所理解的，所述“植物转化载体”含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行dna的转移和vir介导的dna转移的毒力功能(vir基因)(hellens和mullineaux,trends in plantscience,(2000)5：446-451)。

26、用于转化宿主植物细胞的适合方法包括可将dna引入到细胞中(例如将重组dna构建体稳定地整合到植物染色体中)的任何方法是本领域熟知的。用于将重组dna构建体引入到植物中的示例性的且广泛利用的方法是本领域技术人员熟知的土壤杆菌转化系统。用于将重组dna构建体引入到植物中的另一种示例性方法是通过定点整合的方法将重组dna构建体插入到预先确定的位点处的植物基因组中。定点整合可通过本领域已知的的任何方法来实现，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale内切核酸酶、或rna指导的内切核酸酶(如crispr/cas9系统)来实现。转基因植物可通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。用于再生植物的方法在本领域也是熟知的。例如，已经利用ti质粒载体用于传送外源dna，以及直接dna摄入、脂质体、电穿孔、显微注射以及微弹。

27、本发明中术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等。

28、本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

29、术语“蛋白”、“蛋白质”在本发明中可互换地使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述氨基酸残基的聚合物中的一个或多个氨基酸残基是一个相应的天然存在的氨基酸的一种人工化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本发明的蛋白质可以重组产生，也可以通过化学合成。

30、本发明中术语“转基因”是指由于人类干预(例如植物转化方法)合并入生物体基因组中的dna分子。

31、本发明中使用的冠词“一个”和“一种”是指一个(种)或多于一个(种)(即至少一个)。例如，“一种要素”表示一种或多种要素(元件)。

32、本发明提供了一种嵌合启动子及其用途，具有与对照启动子相比显著提高的调节活性。

33、下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。