绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法

本发明属于生物解毒剂，具体涉及绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法。

背景技术：

1、呕吐毒素，学名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, don），是饲料中一种常见的霉菌毒素，极易对猪产生毒害作用。don对猪产生的生殖毒性主要表现在don可抑制母猪子宫细胞增殖，阻碍卵母细胞和胚胎发育；导致猪卵巢氧化损伤，卵巢颗粒细胞的形态变化和凋亡，并抑制细胞增殖；导致公猪睾丸支持细胞结构破坏、细胞周期停滞和氧化应激。此外，don对猪胎盘滋养层（ptr）细胞也产生了毒害作用，具体表现在细胞活力下降、细胞增殖抑制、抗氧化能力下降和迁移能力下降。

2、绿原酸（chlorogenic acid, cga），是由咖啡酸（caffeic acid）和奎尼酸（1-hydroxyhexahydrogallic acid）产生的缩醛酸。它是植物在有氧呼吸过程中通过莽草酸途径产生的一种苯基丙烯酸酯多酚化合物。研究表明cga可以提高精液中精子活力和质膜完整性；提高体外成熟期间猪卵母细胞的成熟、受精和发育能力，并减少热应激损伤；改善猪受精卵和胚胎发育。因此，cga能够改善猪的繁殖性能。关于cga对猪胎盘滋养层细胞的影响，目前尚无报道。

3、现有技术（戴超辉等，呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法，申请号：202411040253.1）提及到don对猪胎盘滋养层（ptr）细胞的毒害作用，但并没有给出具体的解决方案。现有技术（尹清强等，绿原酸化合物在制备治疗由don引起炎症的药物中应用，申请号：201911221469.7）提及到绿原酸对呕吐毒素诱导猪肠道上皮细胞炎症和凋亡的保护作用，但并不涉及对猪胎盘滋养层细胞增殖、迁移和抗氧化能力的影响。鉴于妊娠早期胚胎附植对产仔数的重要影响，而胎盘滋养层细胞又直接决定胚胎附植的效率，本发明旨在通过探究cga的安全浓度和处理时间，评估cga对don诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的缓解效果，为利用cga改善猪繁殖性能提供新的思路和更多试验依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，优化了绿原酸处理猪胎盘滋养层细胞的条件，包括cga的安全浓度和处理时间，以及评估cga对don诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的缓解效果，将为利用cga改善猪繁殖性能提供新的思路和更多试验依据。

2、为解决上述技术问题，本发明的实施例提供绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，包括以下步骤：

3、步骤一、将猪胎盘滋养层细胞接种至96孔板，更换培养基，加入cga处理细胞，cga浓度设定为：0、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml；时间设定为：24h、48h和72h后；处理结束后每孔加入10μl的cck-8溶液，在37℃下恒温孵育2h，用酶标仪检测在450nm处的吸光度值，计算细胞存活率，筛选出cga在ptr细胞中的安全剂量和处理时间；

4、步骤二、将猪胎盘滋养层细胞接种至96孔板，更换培养基，设置4个处理组，包括：nc对照组、don处理组、cga处理组和don+cga处理组；其中，don浓度设定为0.5μg /ml，cga浓度设定为：50μg /ml；时间设定为48h，处理结束后每孔加入10μl的cck-8溶液，在37℃下恒温孵育2h，用酶标仪检测在450nm处的吸光度值，计算细胞存活率，评估cga对 don诱导猪胎盘滋养层细胞活力抑制的缓解效果；

5、步骤三、将猪胎盘滋养层细胞接种至12孔板，设置4个处理组，包括：nc对照组、don处理组、cga处理组和don+cga处理组；其中，don浓度设定为0.5 μg /ml，cga浓度设定为：50μg /ml；时间设定为48h；处理结束后收集细胞总rna，反转录成cdna，利用2-δδct方法计算基因的相对表达水平；收集细胞总蛋白，利用western blot分析蛋白表达水平，评估cga对don诱导猪胎盘滋养层细胞增殖抑制、氧化应激和迁移抑制的缓解效果；

6、步骤四、利用步骤三中12孔板培养猪胎盘滋养层细胞，待细胞密度达90%后，用10μl枪头垂直于培养板底面画线制造划痕，在48h处统计各组细胞的划痕宽度，评估cga对don诱导猪胎盘滋养层细胞迁移能力抑制的缓解效果，得到cga缓解don诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法。

7、其中，步骤一和步骤二中所述猪胎盘滋养层ptr细胞在试验前进行处理：将猪胎盘滋养层ptr细胞接种至含10%胎牛血清的dmem/f12培养液中，置于含5%co2的37℃恒温培养箱培养，长满后消化传代。

8、其中，步骤三中，所述基因表达水平表现于针对ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip为目的基因对不同处理组ptr细胞进行目的基因表达水平检测，并以gapdh为内参对目的基因的表达进行均一化。步骤三中，所述蛋白表达水平表现于针对ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip为目的蛋白对不同处理组ptr细胞进行目的蛋白表达水平检测，并以β-actin为内参对目的蛋白条带的灰度值进行均一化。

9、其中，步骤四中，计算细胞划痕愈合率采用以下公式：

10、细胞划痕愈合率(%) =［（t0时划痕宽度值-tt时划痕宽度值）/t0时划痕宽度值］×100。

11、本发明上述技术方案的有益效果如下：

12、本发明优化了绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，包括cga的安全浓度和处理细胞的时间，以不同浓度cga处理ptr细胞，通过cck-8检测细胞存活率，确定cga处理ptr细胞的安全浓度为25-75μg/ml，处理时间为48 h以内。以不同处理组ptr细胞针对ccnd1、cdk4 、sod1、cat和cemip为目的基因利用2-δδct方法计算基因的相对表达水平，利用western blot检测蛋白的表达水平，并以细胞划痕实验检测ptr细胞迁移能力，评估cga对don的缓解效果。本发明确定cga的缓解作用表现在cga能够缓解don诱导的ptr细胞活力抑制、增殖抑制、迁移抑制和抗氧化能力下降，最终确定50μg/ml的cga处理ptr细胞48h可显著缓解don诱导的ptr细胞损伤，将为利用cga改善猪繁殖性能提供新的思路和更多试验依据。

1.一种绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，其特征在于，步骤一和步骤二中所述猪胎盘滋养层细胞在试验前进行处理：将猪胎盘滋养层细胞接种至含10%胎牛血清的dmem/f12培养液中，置于含5%co2的37℃恒温培养箱培养，长满后消化传代。

3.根据权利要求1所述的绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，其特征在于，步骤三中，所述基因表达水平表现于针对ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip为目的基因对不同处理组的猪胎盘滋养层细胞进行目的基因表达水平检测，并以gapdh为内参对目的基因的表达进行均一化；步骤三中，所述蛋白表达水平表现于针对ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip为目的蛋白对不同处理组的猪胎盘滋养层细胞进行目的蛋白表达水平检测，并以β-actin为内参对目的蛋白条带的灰度值进行均一化。

4.根据权利要求1所述的绿原酸缓解呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的方法，其特征在于，步骤四中，计算细胞划痕愈合率采用以下公式：