一株抑制棉花黄萎病菌的侧孢短芽孢杆菌及其应用

本公开涉及微生物，具体地，涉及一种侧孢短芽孢杆菌及其应用的。

背景技术：

0、技术背景

1、棉花黄萎病(verticillium wilt)是国内外最严重而且也是最难治理的真菌病害之一，其分布广泛、为害严重，每年都给农业生产造成巨大的经济损失。由于黄萎病菌腐生能力强、寄主范围广，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。目前我国生产上防治棉花黄萎病以溴甲烷和一些化学农药为主，溴甲烷和化学药剂的长期反复使用已经使病原菌产生了明显的抗药性，导致防效下降甚至丧失，用药量不断增加，而长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留量增加的问题也越来越突出。由于棉花黄萎病是一种土传病害，病原菌对寄主的寄生专化性不强，作物品种间特异抗性差异很小或没有。利用有益微生物进行生物防治不但经济有效，而且无副作用。因此，利用有拮抗作用的微生物进行生物防治是一条有探索价值的新途径。近年来，世界主要棉区普遍开展了采用拮抗微生物来控制棉花黄萎病危害的生物防治研究。

2、对棉花黄萎病的生物防治研究目前已取得比较大的进展，已报道筛选到对棉花黄萎病菌有较强作用的枯草芽孢杆菌ncd-2、芽孢杆菌shz-24、sht-15、smt-24、bhz-29、蜡状芽孢杆菌yupp-10、

3、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、木霉、球毛壳菌、链霉菌td3-2-1、白浅灰链霉菌株kf-43-1等菌株对棉花黄萎病菌具有一定的拮抗作用。应用最多当属枯草芽孢杆菌，河北植物保护所马平团队研发的枯草芽孢杆菌ncd-2，对棉花黄萎病的防效超过70.00％，已被开发为微生物农药，于2015年正式登记。但目前，开发成产品的主要是枯草芽孢杆菌，其他大部分生防菌株均处于实验室研究阶段，因此，生产上尚缺少用于防治棉花黄萎病的新型微生物农药。

4、侧孢短芽孢杆菌具有杀虫、杀线、抗菌、抗肿瘤、溶磷、降解有机污染物、生产赖氨酸和多种酶类物质等功能。对侧孢短芽孢杆菌的研究已有近百年的历史，国外的研究一直非常活跃，尤其是俄罗斯、美国、英国、日本、比利时等国更是研究得极为深入。早期的研究主要集中在侧孢短芽孢杆菌的杀虫活性上，它对蚊类、甲虫类昆虫的幼虫以及线虫和软体动物等无脊椎生物具有毒性作用。它们的杀虫活性主要是由于其类芽胞内含物或晶体中含有的蛋白质对很多种昆虫具有毒性作用。侧孢短芽孢杆菌产生的小分子细菌毒素能够抑制线虫卵的孵化或幼虫的发育，可以防治动植物寄生线虫，美国将侧孢短芽孢杆菌制成粉剂用于防治动物的线虫病。我国对该领域也投入了越来越多的关注，云南大学的侧孢短芽孢杆菌杀线虫成果也已得到了应用。印度己完成了三种侧孢短芽孢杆菌菌株全基因组的测序。世界酶制剂巨头丹麦诺维信公司生产的诺沃tm微生物菌剂，其中也含有侧孢短芽孢杆菌。

5、而近年来，有关侧孢短芽孢杆菌抑菌活性的研究越来越受到人们的关注，美国、日本等报道侧孢短芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括非肽类的芽孢菌胺、聚酮化合物、肽类抗生素以及几丁质酶等。以上这些侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌物质主要用于防治临床上已经产生抗药性的革兰氏阳性菌和念珠菌，但对植物病原菌的抑制作用的报道极少。

6、近几年侧孢短芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用越来越受到人们的关注，我国先后报道了侧孢短芽孢杆菌ymf3.100003、b8、1·864、bl-21、2-q-9、s62-9、x10、a60等菌株对植物病原真菌和细菌的抑菌活性。由此可见，虽然国内近几年对侧孢短芽孢杆菌用于植物病害的生防作用展开了初步探索，但相关研究均处于初期阶段，尚没有以侧孢短芽孢杆菌为主要成分的微生物杀菌剂报道，也没有关于侧孢短芽孢杆菌对棉花黄萎病菌抑制作用的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供对于棉花枯萎病菌具有较强的抑制作用、抗菌谱广的新菌株。本发明开展了棉花黄萎病菌生防细菌的筛选，经形态学特征、生理生化及16s rdna分析将筛选获得的菌株鉴定为侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，该菌株对棉花黄萎病菌具有较强的抑制作用，抗逆性强，抑菌活性稳定、抑菌谱广，具有明显的生防潜能，是一株很有开发前途的生防菌，本发明提供了一种对人、畜无毒，对生态环境友好，对棉花黄萎病有良好防效的微生物菌种及其农药产品，特此将该菌株申请发明专利。为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

2、本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906，该侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906的保藏编号为cgmcc no:28281。

3、本发明所提供的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906，于2021年从新疆天山植物根际土壤样品中分离、筛选获得，菌种编号为m1906，经微生物分类学检测鉴定，确定为侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)潜在新菌种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年8月29日，保藏号为cgmcc no:28281。

4、本发明具体提供的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906属于侧孢短芽孢杆菌潜在新菌种，菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上28℃培养2d后菌落呈圆形，乳白色，扁平、边缘较整齐，中央略微凸起，呈轮纹生长、湿润光滑、不产生色素(图1)。菌株形态特征为：菌体呈杆状，大小为(0.4～0.6)×(2.0～2.5)μm，有周生多鞭毛，能运动。革兰氏染色阳性。芽孢椭圆形，侧生、孢囊膨大，呈独木舟状。生理生化特征为：厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不产生淀粉酶、硝酸盐还原酶和l-苯丙氨酸脱氨酶，不能利用柠檬酸盐。。

5、以侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906的基因组总dna为模板扩增其16s rdna序列，经pcr扩增和测序，菌株m1906的16s rdna序列长度为1427bp，将16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果表明菌株m1906与侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)bl-2(id:dq371289.2)的基因序列同源性为98.59％，进一步表明侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus lateros porus)m1906是有别于现有的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterospo rus)的新种。

6、进一步的，本发明还提供侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterospo rus)m1906的培养方法，将侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906接种至na固体培养基进行培养。

7、本发明提供侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906的培养方法，培养温度为25～28℃，ph 7.0～7.2。

8、进一步的，本发明还提供一种防治棉花黄萎病的水剂，所述水剂包含侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906发酵物。

9、进一步的，本发明还提供所述的一种防治棉花黄萎病的水剂的制备方法，采用如下方法制备获得：将侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906转接至新鲜斜面培养基上，28℃条件下培养1d后，接种至装液量100ml的500ml三角瓶内，在28℃，转速为180r/min的旋转式摇床上振荡培养20h制备种子液，以3％体积比接入液体发酵培养基中，28℃，转速为180r/min，培养48～72h，待发酵液中95％菌体形成芽孢，其活芽孢数为1×108～1×109cfu/ml，即获得水剂。

10、进一步的，本发明提供所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus late rosporus)m1906在抑制棉花黄萎病菌活性中的应用。

11、进一步的，本发明提供所述的防治棉花黄萎病的水剂在抑制棉花黄萎病菌活性中的应用。

12、进一步的，本发明提供所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus late rosporus)m1906在抑制棉花黄萎病菌活性中的应用。

13、进一步的，本发明提供所述的防治棉花黄萎病的水剂在防治棉花黄萎病中的应用。

14、进一步的，本发明提供所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus late rosporus)m1906在防治棉花黄萎病中的应用。

15、进一步的，本发明提供所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus late rosporus)m1906在抑制植物病原活性中的应用。

16、所述的植物病原菌包括但不限于黄瓜枯萎病菌(fusarium oxyspo rum)、番茄灰霉病菌(botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(alternaria sol ani)、枣果黑斑病菌(alternaria alternata)、辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)、玉米茎基腐病菌(fusarium graminearum)和黄芪黄萎病(ver ticillium dahliae)病菌中的一种或几种。

17、通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果∶

18、(1)本发明所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906对人畜无毒，对生态环境友好，能够制备成为对棉花黄萎病有良好防效地微生物菌种及其农药产品，对棉花黄萎病菌具有很强的抑制作用，无菌发酵滤液对棉花黄萎病菌的抑制率达91.37％，可使棉花黄萎病菌菌丝畸形、断裂，细胞膜改变，原生质体外渗，菌丝消融等。菌株m1906可产几丁质酶，其无菌发酵滤液对棉花黄萎病菌菌核产生的抑制率达到100％；对菌核萌发的抑制率达49％，并能延迟菌核萌发，且处理组的菌核萌发后菌丝生长量明显少于对照组，菌丝生长速度缓慢。盆栽试验结果表明在接种棉花黄萎病菌前喷施m1906水剂对棉花黄萎病的防效为82.52％；在接种棉花黄萎病菌之后喷洒m1906水剂，对棉花黄萎病的防效为82.52％

19、(2)本发明所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)m1906无菌发酵滤液抑菌谱较广，对黄瓜枯萎病菌(fusarium oxyspo rum)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(alternaria sol ani)、枣果黑斑病菌(alternaria alternata)、辣椒疫霉菌(phytophthor a capsici)、玉米茎基腐病菌(fusarium graminearum)和黄芪黄萎病菌(verticillium dahliae)等植物病原菌具有一定的抑制作用，对于农业病害防治提供了新的思路和方法，对于推动绿色农业的发展具有巨大的潜在价值。