一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量PCR技术检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物诊断，具体涉及一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒。

背景技术：

1、黄颡鱼杯状病毒（yellow catfish calicivirus, yccv）全基因组长为7432bp，分类于小rna病毒目中的杯状病毒科caliciviridae，是一种近年来新发现的黄颡鱼病毒性疾病，病原为杯状病毒，主要发生于春后。感染该病毒的黄颡鱼会出现聚堆、趴边、游水、头朝上尾朝下、螺旋状狂游等异常行为，以及下颌、鳃盖和口腔基部出血，肝脏色浅，脾脏充血，肾脏肿大、坏死等病理变化，限制了鱼类养殖业的发展，因此，黄颡鱼杯状病毒的检测和鉴定对于疾病的预防和控制至关重要。

2、现有的黄颡鱼杯状病毒检测方法主要包括传统的病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等。比如在中国专利cn202110574113.2中公开了以调控病毒复制的关键基因即病毒的非结构蛋白(nonstructural protein,ns)，设计两条引物对该病毒进行检测，该专利利用的方法为常规pcr方法检测，存在操作繁琐、检测限高且pcr后需要开盖进行凝胶电泳进一步确定诊断结果，容易造成交叉污染。现有的检测方法存在操作复杂、检测周期长、灵敏度和特异性不足等问题，难以满足养殖业对快速、准确检测的需求，而且都是液态试剂，保存稳定性差，应用范围有限。

3、基于此，亟需开发一种快速、灵敏、特异的黄颡鱼杯状病毒检测试剂盒。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明设计了一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等优点。

2、为了实现上述目的，本发明解决技术问题采用如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，所述试剂盒包括pcr mix，阳性对照、阴性对照、复溶剂；

4、其中，所述pcr mix为冻干试剂，包括50~500mm核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物、50~500nm核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物、25~250nm 核苷酸序列如seq id no.3所示的taqman荧光探针。

5、本发明制备的冻干剂型的pcr mix在储存运输过程不需要进行冷链运输，大大降低了试剂运输的成本，在运输过程中不会出现试剂失效的风险，且该冻干剂型的pcr试剂中含有尿嘧啶-dna糖基化酶防污染体系，并以dutp替代dttp作为pcr原料，在进行pcr扩增时，尿嘧啶-dna糖基化酶能消化pcr产物中含u的pcr产物，进而防止pcr产物气溶胶污染，保证冻干剂型的pcr试剂检测效果。

6、优选地，所述pcr mix还包括1u~10u rnase抑制剂、体积比为1%~50%的甘油、10mm~200mm钾离子、0.01~1mm edta、20mm~80m且ph为7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm含u的dntp、100mm~4m kcl、1mm~50mm mgcl2、体积比为0.01~0.3%的tween-20、体积比为0.01~0.1%的四氢噻吩1-氧化物、10mm~5m四甲基氯化铵、10mm~100mm甜菜碱、体积比为0.01~0.1%的dmso、体积比为0.01~0.3%的triton x-100。

7、优选地，所述pcr mix还包括0.5~2u热启动taq酶、0.5~5u反转录酶、0.1u~10u udg酶。

8、优选地，所述pcr mix还包括体积比为30.3%的冻干保护剂。

9、优选地，所述冻干保护剂包括海藻糖1~15%、蔗糖1~15%、甘露醇1~15%、聚乙二醇0.01~0.5%、2%~10%卵磷脂和2%~10%环糊精。

10、优选地，所述复溶剂为nuclease-free water。

11、另一方面，本发明还提供了一种非诊断目的检测黄颡鱼杯状病毒的方法，其特征在于，采用所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒。

12、优选地，所述方法包括以下步骤：

13、s1:提取样本核酸；

14、s2:将20μl复溶剂加入pcr mix中，再加入5μl步骤s1提取的核酸溶液，进行pcr扩增反应，反应结束后对检测结果进行判定。

15、优选地，所述pcr扩增反应条件为：50℃ 1min；95℃ 2min；95℃ 10s，59℃ 30s，40个循环。

16、优选地，所述结果判定为：当ct值＜35，则结果为阳性；当35≤ct＜37扩增曲线呈s型，可疑样本需复检；复检结果一致则判断为阳性，否则为阴性；当ct值≥37或无扩增曲线，结果为阴性。

17、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

18、本发明提供了一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，所述试剂盒中的pcr mix为可冻干试剂，各组分与冻干保护剂相互配合，在具有高灵敏度、高特异性的同时，还能保证常温下的稳定，无需复杂的冷链物流，降低了运输和储存的成本与复杂性。其次，使用时只需加入适当的溶剂即可迅速恢复活性，简化了实验步骤。此外，冻干技术允许将多种不相容的试剂共同冻干，减少了交叉污染的风险，解决了现有黄颡鱼杯状病毒检测试剂保存稳定差、对温度敏感、实验操作复杂，从而检测结果不稳定的问题。

19、本发明还提供了使用该试剂盒检测黄颡鱼杯状病毒的方法，并优化了pcr扩增条件，可以快速准确检测黄颡鱼杯状病毒，操作简单，易于在偏远地区等资源有限的环境中使用，而且减少了操作过程中可能出现的人为错误，提高了检测结果的准确性和可靠性。同时在紧急情况下，也有利于快速开展大规模的病毒筛查以及实现对黄颡鱼杯状病毒实时监测，有利于鱼类养殖业的健康发展，也为黄颡鱼杯状病毒检测技术提供了新思路。

1.一种冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr mix，阳性对照、阴性对照、复溶剂；

2.根据权利要求1所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述pcr mix还包括1u~10u rnase抑制剂、体积比为1%~50%的甘油、10mm~200mm钾离子、0.01~1mm edta、20mm~80m且ph为7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm含u的dntp、100mm~4m kcl、1mm~50mm mgcl2、体积比为0.01~0.3%的tween-20、体积比为0.01~0.1%的四氢噻吩1-氧化物、10mm~5m四甲基氯化铵、10mm~100mm甜菜碱、体积比为0.01~0.1%的dmso、体积比为0.01~0.3%的triton x-100。

3.根据权利要求1所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述pcr mix还包括0.5~2u热启动taq酶、0.5~5u反转录酶、0.1u~10u udg酶。

4.根据权利要求1所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述pcr mix还包括体积比为30.3%的冻干保护剂。

5.根据权利要求4所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖1~15%、蔗糖1~15%、甘露醇1~15%、聚乙二醇0.01~0.5%、2%~10%卵磷脂和2%~10%环糊精。

6.根据权利要求1所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒，其特征在于，所述复溶剂为nuclease-free water。

7.一种非诊断目的检测黄颡鱼杯状病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1~6任一项所述的冻干型黄颡鱼杯状病毒的荧光定量pcr技术检测试剂盒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应条件为：50℃ 1min；95℃2min；95℃ 10s，59℃ 30s，40个循环。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结果判定为：当ct值＜35，则结果为阳性；当35≤ct＜37扩增曲线呈s型，可疑样本需复检；复检结果一致则判断为阳性，否则为阴性；当ct值≥37或无扩增曲线，结果为阴性。