一种miRNA的信号放大方法及其应用

本发明属于生物检测领域，涉及基于靶标触发滚环扩增信号放大策略构建电化学生物传感器在micrornas检测中的应用。

背景技术：

1、micrornas(mirnas)是一类长度为18-25个碱基的非编码rna。研究表明，一些mirnas通过靶向不同或相似的基因，参与了细胞周期和肺癌生长的调控，包括细胞凋亡、血管生成、侵袭和转移。因此，开发具有高灵敏度和特异性的定量分析方法来检测体液中mirnas的类型和表达水平，对实现肺癌早期诊断、病理分析、提供预后评估具有重要意义。northern印迹分析、rt-pcr、微阵列芯片是最常见的mirna检测方法，但它们存在灵敏度低，存在交叉反应或干扰、耗时耗力等不足，限制了其在临床实际中的应用，亟需开发快速、简便的mirna检测方法。

2、科研工作者开发了各种基于电化学传感技术的新型mirnas检测方法。例如：kimura-suda h课题组证实核苷酸序列与aue之间具有吸附亲和力作用，其趋势是：a碱基>c碱基≥g碱基>t碱基。在该研究基础上，koo km研究小组通过靶mirnas末端与多聚(a)序列延伸，以促进mirna-aue表面之间吸附，便于后续研究。该传感器可高灵敏地检测mirnas，其检测限为10fm。但由于循环mirnas在血中的含量极低，导致该传感器仍然无法满足临床检测的实际需求。

技术实现思路

1、为解决上述不足，本发明开发了一种超灵敏检测mirna(如mirna-21)的新型电化学传感技术。具体地，

2、本发明第一方面提供了一种用于mirna检测的锁式探针，所述探针含有两端区域和中间区域；所述两端区域为5’端区域和3’端区域，所述5’端区域含有靶标待检测mirna的识别序列1，所述3’端区域含有靶标待检测mirna的识别序列2；所述中间区域富含t碱基。

3、在某些实施方式中，所述识别序列1与待检测mirna的区段a杂交，识别序列2与待检测mirna的区段b杂交；所述杂交为完全杂交或部分杂交；所述区段a和区段b不重叠。

4、在某些实施方式中，所述区段a的3’端与区段b的5’端紧密相连或间隔小于5个核苷酸或者区段b的3’端与区段a的5’端紧密相连或间隔小于5个核苷酸；所述间隔小于5个核苷酸为间隔4个，3个，2个，1个或0个核苷酸；优选地，间隔0个核苷酸。

5、在某些实施方式中，所述识别序列可与待检测mirna杂交，使探针的两个末端贴近在一起。

6、在某些实施方式中，所述识别序列1和识别序列2的长度分别为8-14bp；所述识别序列1和识别序列2的长度相同或不同；优选地，所述识别序列1和识别序列2的长度分别为11bp。

7、在某些实施方式中，所述中间区域含有6-15个t碱基；优选地，含有10个t碱基。

8、在某些实施方式中，所述mirna为mirna-21。

9、在某些实施方式中，所述探针的序列如seq id no：9所示。

10、本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的锁式探针在制备癌症诊断产品中的应用；优选地，所述癌症存在mirna表达异常。

11、在某些实施方式中，所述癌症为肺癌，所述mirna为mirna-21。

12、本发明第三方面提供了mirna检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的锁式探针。

13、在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自dna连接酶、dna聚合酶、dntps和mirna的组分；优选地，所述dna连接酶为t4 dna ligase，所述dna聚合酶为phi29 dnapolymerase，所述mirna为mirna-21。

14、在某些实施方式中，所述检测包括如下步骤：1)锁式探针与待检测mirna杂交，使探针的两个末端贴近在一起；2)采用t4 dna ligase把探针的两个末端连接为环状结构，形成rca反应的环状模板；3)在phi29 dna polymerase和dntps存在的情况下，待检测mirna作为引物持续触发rca反应，由此产生周期性重复的长链dna产物；4)利用该长链dna产物中的a碱基与金电极(aue)之间的强结合力，实现rca产物在aue上的高效组装，rca产物的存在，阻碍了aue表面的电子转移，使电化学信号发生衰减；5)通过差分脉冲伏安法(dpv)监测电化学信号发生衰减，指示待检测mirna的浓度。

15、本发明第四方面提供了一种mirna的信号放大方法，包括如下步骤：1)将本发明第一方面所述的锁式探针与mirna杂交，使探针的两个末端贴近在一起；2)采用t4 dnaligase把探针的两个末端连接为环状结构，形成rca反应的环状模板；3)在phi29 dnapolymerase和dntps存在的情况下，mirna作为引物持续触发rca反应，由此产生周期性重复的长链dna产物实现信号放大。

16、本发明第五方面提供了用于mirnas检测的电化学生物传感器，所述传感器包含待检测mirna、识别元件、感受器、换能器、电化学工作站；所述识别元件为权利要求任一项所述的锁式探针；所述感受器为金电极；所述换能器为计算机。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、本发明首次把滚环扩增技术与a碱基-aue强结合作用相结合，开发了一种超灵敏检测mirna(如mirna-21)的新型电化学传感器，该传感器的构造或组成为：待测物质(如mirna-21)、识别元件(锁式探针)、感受器(金电极)、换能器(电脑)、电化学工作站。该传感器：1)利用扩增技术把低丰度的靶标mirna-21进行富集，以增强电化学响应信号的变化；2)富含多聚t的特异性锁式探针用于滚环扩增反应，赋予了传感器优异的碱基识别能力；3)具有更高的工作效率和更高的精密度，能够更准确地检测靶标物。

19、该传感器无需进行巯基修饰即可完成产物的组装，避免了对电极功能性修饰的复杂性。该方法与传统的pcr技术相比，具有可在等温条件下(无需繁琐的升温、降温过程)进行，对仪器设备的要求较低等明显优势。本研究通过电化学及琼脂糖凝胶电泳实验确定了锁式探针的最佳浓度为100nm、rca产物组装在电极上的最优时间为20min、t4 dna ligase最佳反应时间为0.5h、phi29dna polymerase和t4 dna ligase最佳反应浓度分别为0.17u/μl、15u/μl。在最优的检测条件下，该传感器对100am～100pm浓度范围内的靶标mirna-21具有良好的线性响应，lod为67am，检测性能优于之前报道的检测方法。该传感器具有良好的特异性，能够识别单碱基突变的rna序列，可用于复杂生物样品(细胞、组织和血液)中mirna-21的检测。该传感器具有区分同源mirnas的能力和实际临床应用价值。

1.用于mirna检测的锁式探针，其特征在于，所述探针含有两端区域和中间区域；所述两端区域为5’端区域和3’端区域，所述5’端区域含有靶标待检测mirna的识别序列1，所述3’端区域含有靶标待检测mirna的识别序列2；所述中间区域富含t碱基；所述识别序列1与待检测mirna的区段a杂交，识别序列2与待检测mirna的区段b杂交；所述杂交为完全杂交或部分杂交；所述区段a和区段b不重叠。

2.根据权利要求1所述的锁式探针，其特征在于，所述区段a的3’端与区段b的5’端紧密相连或间隔小于5个核苷酸或者区段b的3’端与区段a的5’端紧密相连或间隔小于5个核苷酸；所述间隔小于5个核苷酸为间隔4个，3个，2个，1个或0个核苷酸；优选地，间隔0个核苷酸。

3.根据权利要求1所述的锁式探针，其特征在于，所述识别序列1和识别序列2的长度分别为8-14bp；所述识别序列1和识别序列2的长度相同或不同；优选地，所述识别序列1和识别序列2的长度分别为11bp。

4.根据权利要求1所述的锁式探针，其特征在于，所述中间区域含有6-15个t碱基；优选地，含有10个t碱基。

5.根据权利要求1-4任一项所述的锁式探针，其特征在于，所述mirna为mirna-21；所述探针的序列如seq id no：9所示。

6.权利要求1-5任一项所述的锁式探针在制备癌症诊断产品中的应用；优选地，所述癌症存在mirna表达异常。

7.mirna检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-8任一项所述的锁式探针；优选地，所述试剂盒进一步包括选自dna连接酶、dna聚合酶、dntps和mirna的组分；更优选地，所述dna连接酶为t4 dnaligase，所述dna聚合酶为phi29 dnapolymerase，所述mirna为mirna-21。

8.一种mirna的信号放大方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将权利要求1-8任一项所述的锁式探针与mirna杂交，使探针的两个末端贴近在一起；2)采用t4 dna ligase把探针的两个末端连接为环状结构，形成rca反应的环状模板；3)在phi29 dnapolymerase和dntps存在的情况下，mirna作为引物持续触发rca反应，由此产生周期性重复的长链dna产物实现信号放大。

9.用于mirna检测的电化学生物传感器，其特征在于，所述传感器包含待检测mirna、识别元件、感受器、换能器、电化学工作站；所述识别元件为权利要求1-8任一项所述的锁式探针；所述感受器为金电极；所述换能器为计算机。