一种重组人源Ⅱ型胶原蛋白、核酸分子、载体、细胞、组合物及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程、合成生物学，具体而言，涉及一种重组人源ⅱ型胶原蛋白、核酸分子、载体、细胞、组合物及其应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。目前已经发现的胶原蛋白约有20种。胶原蛋白是基底膜、骨骼、软骨等结构的支架，对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成屏障等作用。其除了生物力学方面的作用以外，还可通过细胞外基质受体分子与细胞间实现信号传递，参与调控细胞的行为。胶原可直接与细胞表面受体结合，也可间接与其它中介分子结合后，参与细胞表面受体识别及信号传导过程。胶原在其依赖性的动态细胞活动中也起到非常重要的作用，如组织重建，包括形态学的发生过程和创面的愈合，在免疫系统调控以及止血和血栓形成等方面也有重要作用。

2、基因工程生产的重组人源胶原蛋白，是将人体胶原蛋白基因进行特定序列设计、酶切和拼接、连接载体后转入工程细胞，通过发酵表达生产的胶原蛋白及其类似物的技术。目前已有多种通过基因工程生产重组人源性胶原蛋白的方法，各方法全面涉及到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、转基因作物等不同表达体系。由于动物细胞表达体系存在成本高昂、周期长等问题，而转基因作物提取、纯化胶原技术难度大、成本高、产率极低，因此目前可进入工业化生产或已商品化的重组胶原蛋白主要采用基于大肠杆菌、酵母等微生物发酵的技术，具体产物包括i型或iii型的全长/非全长的重组人源胶原蛋白。与动物组织来源的天然胶原相比，采用微生物发酵的重组胶原蛋白具有较好的可加工性(如水溶性和乳化特性)，能更好的控制致病病毒传播的风险，且可通过序列设计尽可能的降低免疫原性。

3、ⅱ型胶原是软骨基质的主要胶原成分，在保持软骨结构紧密型和生物力学特性方面起到重要作用。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组人源ⅱ型胶原蛋白、核酸分子、载体、细胞、组合物及其应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种重组人源ⅱ型胶原蛋白，该重组人源ⅱ型胶原蛋白的氨基酸序列是从全长序列中截取的一段序列，其氨基酸序列位于天然的人源ⅱ型胶原蛋白的第579位-第1265位氨基酸序列。

4、第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的重组人源ⅱ型胶原蛋白。

5、第三方面，本发明提供了一种载体，其包括上述的分离的核酸分子。

6、第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其包括：上述的载体。

7、第五方面，本发明还提供了重组人源ⅱ型胶原蛋白在制备医疗器械和组合物中的应用。

8、第六方面，本发明还提供了一种组合物，其包括上述的重组人源ⅱ型胶原蛋白。

9、第七方面，本发明还提供了生产上述的重组人源ⅱ型胶原蛋白的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。

10、第八方面，本发明还提供了重组人源ⅱ型胶原蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、和/或上述的组合物在制备试剂盒中的用途，试剂盒用于如下至少一项的用途：

11、(1)增加细胞粘附；(2)软骨修复；(3)增加骨质粘合力；(4)防治骨质疏松；(5)促进成骨细胞增殖。

12、本发明具有以下有益效果：

13、(1)本发明提供的重组人源ⅱ型胶原蛋白包括天然人源ⅱ型胶原蛋白的钙离子结合域，不包含胶原区的c-端、n-端的氨基酸序列，是天然人ii型胶原蛋白的截短蛋白，具有免疫原性小的优势。

14、(2)重组人源ⅱ型胶原蛋白中的钙离子结合域具有促进成骨细胞增殖的作用，因此，重组人源ⅱ型胶原蛋白在制备医疗器械和组合物中具有良好的应用前景。

15、(3)本发明提供的重组人源ⅱ型胶原蛋白可以在常用表达系统中表达，特别是毕赤酵母工程菌中表达生产，具有表达量高、无内毒素隐患的优势。而且，该重组人ⅱ型胶原蛋白可以不携带组氨酸标记等纯化标签，可通过分子筛进行纯化，最终直接可得目的蛋白，不需要额外切除组氨酸标记等纯化标签。

16、(4)本发明的重组人源ⅱ型胶原蛋白生产方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。

1.一种重组人源ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源ⅱ型胶原蛋白的氨基酸序列是从全长序列中截取的一段序列，其氨基酸序列位于天然的人源ⅱ型胶原蛋白的第579位-第1265位氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno.1所示。

3.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-2任一项所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白。

4.一种载体，其特征在于，其包括权利要求3所述的分离的核酸分子；

5.一种宿主细胞，其特征在于，其包括：权利要求4所述的载体；

6.如权利要求1-2任一项所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白在制备医疗器械和组合物中的应用；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物为药物组合物或保健品。

8.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白。

9.生产权利要求1-2任一项所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。

10.如权利要求1-2任一项所述的重组人源ⅱ型胶原蛋白、权利要求3所述的分离的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、和/或权利要求8所述的组合物在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于如下至少一项的用途：