一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基及方法与流程

本发明涉及一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基及方法，属于干细胞。

背景技术：

1、间充质干细胞(msc)在细胞和组织修复治疗中发挥着多重作用，以及具有良好的可获取性和通用性，被认为是临床细胞治疗的重要药物。然而，在成年个体的多种组织中，msc的存在数量相对较少，限制了其在临床治疗中的直接应用。为了获得足够的细胞量以满足临床给药的需求，必须对成体组织来源的msc进行体外扩增，这一过程往往需要长时间的传代。

2、传统的msc扩增方法主要采用的是平面二维体系扩增法，这种方法存在一些局限性，长期在二维平面体系中传代的细胞，可能会出现功能下降、老化和增殖速度减缓等问题，特别是细胞老化现象，会显著影响细胞治疗的最终效果。为了确保疗效，通常推荐使用体外扩增4代至6代的人类及动物成体组织msc。因此，如何克服在二维平面培养体系中msc易老化的问题，以及如何提升这些细胞在长期传代过程中的扩增能力，成为了干细胞治疗领域亟需解决的一个技术问题。这一技术问题是否得到解决直接关系到细胞的药效和产量，对于提高临床治疗的成功率具有重大的影响。

3、为了解决上述技术问题，本领域技术人员正在探索多种新的方法和技术。三维培养体系可以为细胞提供更加接近生理状态的环境，有助于维持细胞的多向分化潜能和延长细胞的生命周期。此外，自动化和计算机控制的生物反应器技术可以提供更加精确和可控的培养条件，优化细胞的扩增效率；基因改造技术的应用，如crispr-cas9基因敲除技术、病毒超表达系统等，也为改善msc的特性和功能提供了新的可能性。

4、然而，3d培养、自动化控制及基因改造等方法存在高成本、不易规模化等缺点，如果能在二维平面扩增体系中改善msc的老化、增殖能力，达到降低成本、易于进行规模化的效果，将有助于解决msc细胞产业化面临的问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的上述技术问题，提供一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基及方法。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明的目的之一在于提供一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，包括camp(环磷腺苷)通路激活剂和双特异性络氨酸磷酸化调节激酶抑制剂。

4、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做出如下的改进：

5、进一步，所述camp通路激活剂为毛喉素(forskolin)。

6、进一步，所述双特异性络氨酸磷酸化调节激酶抑制剂为indy，其中，indy即1-(3-乙基-5-羟基-1,3-苯并噻唑-2-亚甲基)丙酮，cas号为1169755-45-6。

7、进一步，所述间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基包括细胞基础培养基、体积分数为10％的胎牛血清、10μm毛喉素、20μm indy。

8、进一步，所述细胞基础培养基为dmem低糖培养基。

9、进一步，该间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基的配置过程包括以下步骤：

10、(1)准备细胞基础培养基、胎牛血清、10mm浓度的毛喉素、20mm浓度的indy以及酸碱度调节剂；

11、(2)按照各组分的组成和配比，将胎牛血清、毛喉素、indy加入所述细胞基础培养基中，混合均匀；

12、(3)调节酸碱度：检测步骤(2)得到的初品培养基的ph值，调整ph值至7.0-7.5，过滤，即得到所述间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，进行室温复温后，可用于msc培养。

13、进一步，所述酸碱度调节剂为naoh溶液和nahco3溶液，其中，naoh溶液浓度为1mol/l，nahco3溶液质量体积分数为1％。

14、进一步，步骤(1)中，

15、毛喉素的配置包括：毛喉素加入二甲基亚砜中溶解完全得到10mm浓度的毛喉素；

16、indy的配置包括：indy加入至二甲基亚砜中溶解完全得到20mm浓度的indy。

17、本发明的目的之二在于提供一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的方法，采用上述间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，培养方式选择二维平面培养。

18、进一步，上述方法具体包括以下步骤：

19、(1)间充质干细胞进行复苏后，或者传代消化后，离心去除残留冻存液收集单细胞，用所述间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基重悬后，以2.0x106细胞/平方厘米的密度在二维平面培养器具中接种，在细胞培养箱中以37℃、5％co2条件静置培养；

20、(2)培养4-5天后进行传代：每天进行换液，并观察细胞形态及汇合度，至80％以上汇合度后，使用胰酶或者accutase进行细胞消化，使用含有胎牛血清的培养基进行终止消化后，离心计数，继续重复(1)中接种方法，进行二维平面静置培养；

21、(3)后续传代：参考(2)中操作进行培养，每4-5天传一代，使用胰酶或者accutase将培养的细胞消化为单细胞，同上操作进行传代培养。

22、进一步，所述二维平面培养器具为培养瓶、培养皿或者培养孔板。

23、本发明的有益效果在于：本发明提出了使用camp通路激活剂毛喉素(forskolin)和双特异性络氨酸磷酸化调节激酶(dyrk1蛋白)抑制剂indy促进间充质干细胞体外扩增和延缓细胞老化的方法，msc采用本发明的培养基进行近15代培养后，表面标记蛋白、三向分化功能仍然维持正常，同时与常规培养基培养的p10代msc相比，其在增殖速度、细胞老化等指标上具有明显改善。

1.一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，包括camp通路激活剂和双特异性络氨酸磷酸化调节激酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，所述camp通路激活剂为毛喉素。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，所述双特异性络氨酸磷酸化调节激酶抑制剂为indy。

4.根据权利要求1或2或3所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，包括细胞基础培养基、体积分数为10％的胎牛血清、10μm毛喉素、20μm indy。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，所述细胞基础培养基为dmem低糖培养基。

6.根据权利要求5所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，其配置过程包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，所述酸碱度调节剂为naoh溶液和nahco3溶液。

8.根据权利要求6所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，其特征在于，步骤(1)中，

9.一种间充质干细胞扩增抑制细胞老化的方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的培养基，选择二维平面培养的方式。

10.根据权利要求9所述的间充质干细胞扩增抑制细胞老化的方法，其特征在于，包括以下步骤：