石斛兰DhLCYB基因及其瞬时调控花色的应用

本发明属于分子生物学和生物，涉及石斛兰 dhlcyb基因及其瞬时调控花色的应用，尤其涉及一种利用 dhlcyb基因瞬时改变石斛兰花色的方法。

背景技术：

1、石斛兰为石斛属（ dendrobium）植物，多数具有观赏价值。石斛兰花色艳丽，花型多样，保鲜期长，在切花、盆花、胸花、花束、配餐花等方面得到广泛应用。商品石斛兰的花色主要以紫红色调为主，有少量黄色、绿色和白色等，缺少纯红色、橙色和天蓝色等。根据前期研究，石斛兰的花色素有花青素、类胡萝卜素和叶绿素三大类。花青素是石斛兰花中的主要色素，控制紫红、粉红、桃红等颜色的形成。类胡萝卜素是黄色花中的主要色素，而花青素和类胡萝卜素叠加使花色呈棕红色。培育新奇的花色以及着色模式是石斛兰花色育种研究的热点，而生物育种将为石斛兰花色育种提供更多的可能。

2、类胡萝卜素是异戊二烯代谢产物中最重要的类群，在水果、根和花中以不同的成分和含量存在，吸收可见光，导致黄色、橙色和红色。植物中的类胡萝素的生物合成始于异戊烯基焦磷酸盐及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸酯，主途径上的第一个限速酶是八氢番茄红素合酶（psy）。接下来无色的八氢番茄红素经过一系列催化后形成红色的全反式番茄红素，该色素是番茄和西瓜等主要色素成分。番茄红素的环化是类胡萝卜素生物合成的一个重要分支点，该过程经由两种番茄红素环化酶催化：番茄红素- ε-环化酶（lcye）和番茄红素- β-环化酶（lcyb）。番茄红素经lcye催化生成 δ-胡萝卜素，经lcyb催化生成两端有 β-环的 β-胡萝卜素。番茄红素分子两个末端分别被lcyb和lcye催化，形成有 β-环和 ε-环的 α-胡萝卜素。因此 lcyb基因被认为是改变类胡萝卜素代谢流的关键节点。目前未见观赏石斛兰中 lcyb基因的研究报道。

3、vigs（virus-induced gene silencing，病毒诱导的基因沉默）由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因高度同源的植物内源mrna序列的特异性降解，进而通过表型变异研究目标基因功能。在菊花、百合、牡丹、三色堇、水仙等观赏植物种都有比较成熟的应用。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供 dhlcyb基因及其vigs 技术瞬时改变石斛兰花色的应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了蛋白，为如下任一种：

3、a1）包括序列表中序列2所示的氨基酸残基的蛋白质；

4、a2）将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1) 衍生的蛋白质或与a1）所示的蛋白质具有80％以上的同源性的蛋白质；

5、a3) 将a1）所示蛋白质的末端添加标签蛋白，得到的融合蛋白。

6、上文中，a1）具体为由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质。

7、第二方面，本发明提供了编码第一方面所述蛋白的核酸分子。

8、上文所述核酸分子为如下任一种：

9、b1）编码基因包括序列表中序列1所示的dna分子；

10、b2）在严格条件下与b1）限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；

11、b3）与b1）限定的dna序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。

12、第三方面，本发明提供了含有第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

13、第四方面，本发明提供了第一方面所述蛋白、第二方面所述核酸分子或第三方面所述的重组载体、表达盒或重组菌在调控石斛兰花花色中的应用。

14、第五方面，本发明提供了抑制第一方面所述蛋白的生物学功能的物质或抑制第二方面所述核酸分子表达的物质在如下任一种或者培育具有如下任一种表型的植株中的应用：

15、c1）改变石斛兰花花色；

16、c2）提高石斛兰花中番茄红素含量；

17、c3）提高石斛兰花的花瓣红色程度；

18、c4）使石斛兰花单株形成不同花色。

19、上文提高石斛兰花的花瓣红色程度体现在花瓣色相 a*值提高。

20、上文所述应用中，所述物质为vigs载体；

21、所述vigs载体的作用靶序列为序列1第959-1062bp位或对应于序列1第959-1062bp位，或序列1第1149–1297 bp位或对应于序列1第1149–1297 bp位。

22、进一步地，所述vigs载体为将序列1第959-1062bp位或对应于序列1第959-1062bp位，或序列1第1149–1297 bp或对应于序列1第1149–1297 bp位所示的片段插入pcymmv-pro60载体得到的载体。

23、第六方面，本发明提供了一种改变石斛兰花花色的方法，其包括如下步骤：抑制石斛兰花中第一方面所述蛋白的生物学功能或抑制石斛兰花中第二方面所述核酸分子的表达，得到花色改变的石斛兰花。

24、上文改变石斛兰花花色的方法具体包括如下步骤：

25、d1）构建vigs载体；所述vigs载体的作用靶序列为序列1或对应于序列1第959-1062bp位或序列1或对应于序列1第1149–1297 bp位；

26、d2）将所述vigs载体转入农杆菌，得到重组菌；

27、d3)将所述重组菌导入待改变花色的石斛兰的叶片中后，实现抑制石斛兰花中第一方面所述蛋白的生物学功能或抑制石斛兰花中第二方面所述核酸分子的表达，培养，得到花色改变的石斛兰花。

28、上文所述方法中，所述花色改变的石斛兰花为与所述待改变花色的石斛兰相比，花色种类增多、花色的红色程度增加和/或番茄红素含量提高。

29、上文步骤d3）中，所述导入的时间为所述待改变花色的石斛兰处于抽出10-15cm花序且花芽未开放时期。

30、上文中，所述待改变花色的石斛兰为黄色的金公主。

31、第七方面，本发明提供了一种提高石斛兰花中番茄红素含量的方法，包括如下步骤：抑制石斛兰花中第一方面所述蛋白的生物学功能或抑制石斛兰花中第二方面所述核酸分子的表达，实现提高石斛兰花中番茄红素含量。

32、上文各个方法中，所述抑制石斛兰花中dhlcyb蛋白的生物学功能或抑制石斛兰花中dhlcyb蛋白编码基因表达为通过向石斛兰花中导入vigs载体实现；

33、所述vigs载体为将序列1或对应于序列1第959-1062bp位或序列1或对应于序列1第1149–1297 bp位所示的片段插入pcymmv-pro60载体得到的载体。

34、本发明提供了 dhlcyb基因序列信息，以及用于基于 dhlcyb基因片段构建的 dhlcyb-pcymmv-pro60重组vigs载体及其插入片段序列。本发明所提供的基因片段是从石斛兰中获得的，是 dhlcyb基因cds编码区的一段序列，通过反转录rt-pcr，获得了该基因片段，插入pcymmv-pro60载体构建vigs载体后，转入农杆菌，注射黄色花品种石斛兰，21天左右开出第一朵花色变化的花后，此后花序上开出的每朵花均有花色变化，直至整朵花衰老凋谢，若注射50天以后还有未开放的花芽，则再开出的花颜色恢复正常。

35、本发明的实验证明，本发明采用vigs沉默 dhlcyb基因，使石斛兰花色改变效果显著，且不同植株、不同花朵的表现各异，观赏性强兼具趣味性。叶片注射，不损伤花朵，开花形态正常，无畸形。花色改变效果持久，注射后20-25天可以开出第一朵花色变化的花，此后花序上开出的每朵花均有花色变化，直至整朵花衰老凋谢。