一种正常宫颈类器官的构建和培养方法

本本发明涉及生物医学领域技术，具体是指一种正常宫颈类器官的构建和培养方法。

背景技术：

1、类器官（organoids），是由多能干细胞（pluipotent stem cell, psc）和成体干细胞（adult stem cell, asc）在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。类器官可以在结构和功能上模拟人体器官，在体外长期扩增中具有基因组稳定性，在再生医学、基因编辑、精准医疗、器官发育、疾病建模等方面有良好的应用潜力。类器官模型保留组织原始特征的特性，可以更加准确的反应人体对病原体、药物的反应。这些优势凸显了类器官在个性化治疗中的巨大潜力，特别是在预测药物反应、模拟人体与病原微生物互作方面。

2、宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，高危型hpv持续感染是宫颈癌发生发展的重要原因。因此，建立一套科学严谨的人正常宫颈类器官模型能够为探究hpv感染正常宫颈上皮进而进展成癌提供有力的技术支持。目前，尚未有成熟的人正常宫颈上皮类器官的构建和培养方法。因此，填补这一技术空白对宫颈相关疾病的研究有极大的推动作用。

3、鉴于此，我们提出一种正常宫颈类器官的构建和培养方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种正常宫颈类器官的构建和培养方法。本申请还公开了一种用于正常宫颈组织解离的组织解离液，能够使组织充分解离成单细胞，提高细胞得率。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种正常宫颈类器官的培养基，包括基础培养基advanced dmem/f12、特异性添加因子构成；所述特异性添加因子包括：glutamaxtm、hepes、penicillin/streptomycin/amphotericin b、n-acetyl-l-cysteine(nac)、nicotinamide、a83-01、y-27632、humannoggin、human egf、forskolin、fibroblast growth factor 7、fibroblast growthfactor 10、r-spondin-1、sb202190。

4、优选的，所述特异性添加因子各组分的浓度如下：1x glutamaxtm、10mm hepes、1xpenicillin/streptomycin/amphotericin b、10mm nicotinamide、1mm n-acetyl-l-cysteine(nac)、2μm a83-01、10μm y-27632、10um forskolin、100ng/ml human noggin、50ng/ml human egf、200 ng/ml fibroblast growth factor 7、200ng/ml fibroblastgrowth factor 10、10um r-spondin-1、1um sb202190。所述述特异性添加因子各组分的浓度均以其在基础培养基中的浓度为准。

5、一种正常宫颈类器官的构建方法，包括如下步骤：

6、1）样本处理：样本离体后马上放入组织保存液中，于冰上转运至实验室中，用复合洗涤液对组织进行洗涤后，将正常宫颈组织块剪成小块；

7、2）酶解：将剪碎的宫颈组织转移到组织解离液中，消化处理，使组织充分解离成单细胞悬液；

8、3）红细过筛：终止酶解过程。将裂解后的细胞悬液进行细胞滤网过滤、充分洗涤细胞滤网，收集滤液离心，去上清，得到高纯度的正常宫颈上皮细胞；

9、4）红细胞裂解：向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，冰上放置5min，进行红细胞裂解，再次离心；

10、5）铺板培养：细胞沉淀预先重悬为细胞悬液，用matrigel将细胞悬液进行重悬，铺至未处理孔板中，待基质胶凝固后加入如权利要求1所述的完全培养基，于培养箱中进行培养。

11、优选的，步骤1)中，在样本处理过程中，复合洗涤液成分为：预冷的pbs+100xpenicillin/streptomycin/amphotericin b（三抗），用复合洗涤液处理过的标本能有效避免污染。

12、优选的，步骤2）中的组织解离液包括终浓度为1x的advanced dmem/f12、1xpenicillin/streptomycin/amphotericin b、终浓度为2 mg/ml胶原酶i, 2 mg/ml中性蛋白酶ii，0.4 mg/ml dna酶i、终浓度为10μm的y-27632。

13、优选的，步骤3）中，所需的细胞滤网规格为70um；离心的条件为：离心转速为400g，离心温度为4℃，离心时间为5分钟。

14、优选的，步骤（5）中，细胞沉淀用advanced dmem/f12、5%的fbs溶液于冰上重悬，溶液与基质胶的比例为1：4；基质胶铺至孔板后将孔板置于37℃培养箱内30min待基质胶凝固后，加入如权利要求1所述的完全培养基；每7天更换一次培养基。

15、借由上述技术方案，本发明提供了一种正常宫颈类器官的构建和培养方法。至少具备以下有益效果：

16、（1）、本发明的培养体系能够提高人类正常宫颈类器官构建的成功率并且保证类器官具有活性，能够稳定的传代、冻存、复苏，并且同时适用于宫颈正常类器官长期稳定培养和类器官库扩建，是理想的培养体系。

17、（2）、本发明通过公开了一种用于正常宫颈组织样本解离的组织解离液，该组织解离液能较好地维持细胞活力，使细胞在消化过程中充分释放，提高活细胞得率，并能显著降低成本。

18、（3）、本发明中的复合洗涤液能有效降低胃癌培养中的微生物污染风险，提高人类正常宫颈类器官培养的成功率和存活率。

19、（4）、本发明最大程度模拟了体内生长环境，维持了原发组织的形态结构和基因特征。

1.一种完全培养基，其特征在于：1x glutamaxtm（glutamax™ 补充剂）、10mm hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、1x penicillin/streptomycin/amphotericin b（青霉素-链霉素-两性霉素b溶液）、10mm nicotinamide（尼克酰胺）、1mm n-acetyl-l-cysteine(nac/乙酰半胱氨酸)、2μm a83-01、10μm y-27632、10um forskolin（毛喉素）、100ng/ml human noggin、50ng/ml human egf（人表皮生长因子）、200 ng/ml fibroblast growth factor 7（成纤维细胞生长因子7）、200ng/ml fibroblast growth factor 10（成纤维细胞生长因子10）、10um r-spondin-1、1um sb202190的advanced deme/f12。

2.一种人类正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中复合洗涤液包括：预冷的pbs+100x penicillin/streptomycin/amphotericin b（三抗）。

4.根据权利要求2所述的正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中酶解液包括：1x的advanced dmem/f12、1x penicillin/streptomycin/amphotericin b、终浓度为2 mg/ml胶原酶i, 2 mg/ml中性蛋白酶ii，0.4 mg/ml dna酶i、终浓度为10μm的y-27632。

5.根据权利要求2所述的正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中酶解的时间为2-4小时；消化处理具体条件为：于37℃恒温摇床上，300 rpm/min机械解离消化1-2小时，转移到六孔板内间隔手动吹打，置于37℃培养箱内消化，直到成片宫颈上皮脱落；再加入胰酶使上皮细胞充分解离。

6.根据权利要求2所述的正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中所需的细胞滤网规格为70um；离心的条件为：离心转速为400g，离心温度为4℃，离心时间为5分钟。

7.根据权利要求2所述的正常宫颈类器官模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（5）中细胞沉淀用advanced dmem/f12、5%的fbs溶液进行重悬，溶液与基质胶的比例为1：4；基质胶铺至孔板后将孔板置于37℃培养箱内30min待基质胶凝固后，加入如权利要求1所述的完全培养基。