一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程和微生物，更具体的说是涉及一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用。

背景技术：

1、芽孢杆菌是一种多功能生防细菌，在工业、农业和医药行业中具有广泛的应用。特别是在植物病虫害的生物防治和增强作物的抗逆性方面表现出色。

2、伊短菌素(edeines)由四种非蛋白氨基酸残基(β-tyr/β-phe、isoserine、dapa和dahaa)、一个甘氨酸和一个聚胺组成，包含四种组分(即edeine a、b、d和f)，各组分又有α(a)和β(b)两种同分异构体，区别在于β-异丝氨酸(isoserine)中的羧基跟2,3-二氨基丙酸(dapa)中的α位氨基还是β位氨基形成肽键。伊短菌素对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌都具有强烈抑菌活性，还具有免疫抑制活性。其作用方式与浓度密切有关，当浓度小于15μg/ml时，它能抑制dna的合成，而当浓度超过150μg/ml时，就变成了广谱抑制剂(dna合成、蛋白质翻译和合成)。因此，伊短菌素具有开发为农用或医用抗生素的良好潜力。

3、野生型短短芽孢杆菌x23是烟草根际土壤分离到的广谱拮抗细菌，但野生型x23菌株中edeines的产量较低，限制了其生防效果以及作为农用抗生素的应用。

4、因此，提供一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用，该基因工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传改造，能有效提高伊短菌素的产量。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种基因工程菌，以短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)x23为原始菌株，敲除双组份调控子liars；

4、所述双组份调控子liars基因编号分别为a616_rs05710(sensorhistidinekinase)和a616_rs05715(response regulatortranscription factor)，核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

5、进一步，一种基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

6、(1)利用liars的上下游同源臂、抗性基因和载体骨架，构建同源重组敲除载体；

7、所述抗性基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述抗性基因是aprar；

8、所述liars的上游同源臂核苷酸序列如seq id no.12所示；下游同源臂核苷酸序列如seq id no.13所示；

9、所述载体骨架，以pe194质粒为模板，引物pe194-f/pe194-r扩增得到；

10、(2)利用同源重组技术将短短芽孢杆菌x23基因组中liars进行组合敲除，得到基因工程菌。

11、进一步，引物pe194-f/pe194-r序列如下：

12、pe194-f：cagctgcctcgcgcgtttcggtga；seq id no.6；

13、pe194-r：gttaagggatgcataaactgcatc；seq id no.7。

14、进一步，所述的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。

15、进一步，所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。

16、进一步，所述的方法构建的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。

17、进一步，所述的方法构建的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用

18、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用，本发明通过构建同源重组敲除载体，将野生型短短芽孢杆菌基因组中双组份调控因子liars(基因编号号：a616_rs05710和a616_rs05715)进行组合敲除，成功构建了能够高产伊短菌素的工程菌；本发明构建的短短芽孢杆菌工程菌δliar/s，发酵后伊短菌素的产量与野生型短短芽孢杆菌x23相比分别提高了1.3倍；工程菌为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

1.一种基因工程菌，其特征在于，以短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)x23为原始菌株，敲除双组份调控子liars；

2.权利要求1所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，引物pe194-f/pe194-r序列如下：

4.权利要求1所述的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。

5.权利要求1所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。

6.权利要求2或3所述的方法构建的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。

7.权利要求2或3所述的方法构建的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。