家蚕F7品种抗药性BmCarE-6基因、其调控序列及应用的制作方法

本发明属于分子育种，涉及一种功能基因及其调控序列在家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂分子育种中的应用，具体为家蚕f7品种抗药性bmcare-6基因、其调控序列及应用。

背景技术：

1、家蚕饲养过程中，微量农药中毒事件频发，造成家蚕上簇后结薄皮茧或不结茧，其中，拟除虫菊酯类农药因其残效期较长，成为桑园农药污染的主要来源之一。

2、为了筛选出具有抗菊酯类农药的家蚕品系，本课题组经长期品系培育及筛选，得到家蚕f7品种的菊酯类农药的耐受能力高于常规品种(如大造)100-120倍。且发现，家蚕f7品种对菊酯类农药的抗性可以遗传，因此将其作为研究家蚕抗菊酯类农药的抗性机制的模板，及作为培育抗菊酯类农药的家蚕品种的良好素材。

3、昆虫对农药抗性主要包括三个方面：阻碍抗性、代谢抗性和靶标抗性，其中代谢抗性是最主要的形式。代谢解毒酶对昆虫产生抗药性的作用存在较大差异，酯酶通过水解酯键或与亲脂类有毒物质结合，降低外源杀虫剂浓度，进而增强昆虫杀虫剂的耐受能力。酯酶还通过作用多种酯键如羧酸酯键、磷酸酯键等参与生物体的能量代谢及活性调控。因此，酯酶在昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的耐受机制中起着重要的作用。昆虫对杀虫剂抗性增强原因还与酯酶家族的基因位点突变造成酶活性增强有关。当前昆虫耐药机制研究中，羧酸酯酶的研究主要集中在克隆预测、基因表达调控和酶活性检测等方面。

4、现有技术中，研究者发现大部分昆虫均携带羧酸酯酶基因，但直至目前仅有极少数品种具备抗菊酯类农药的能力。且经本课题组的前期试验可知，该基因为显性基因，因此，猜测该基因的表达水平决定了其功能的发挥。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，提供一种能够抗拟除虫菊酯类农药的功能基因，并提高该基因的表达水平，从而更好的发挥基因的功能，以实现家蚕对拟除虫菊酯类杀虫剂的高耐受性；鉴于此，本发明提供了家蚕f7品种抗药性bmcare-6基因、其调控序列及应用。

2、技术方案：家蚕f7品种抗药性bmcare-6基因，所述基因编码的氨基酸序列如seqid no:1所示；其中，seq id no:1序列如下：

3、mfvllllilgsaiyaesftkkcdvlvkldsgpvcgreesankntkyfsfqgipyakppvgar

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13、优选的，所述基因编码的核苷酸序列如seq id no:2所示；seq id no:2序列(即bmcare-6基因的cds全长序列)如下：

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43、优选的，所述基因的调控序列如seq id no:3所示；其中，seq id no:3序列如下：tccatgcactaatcataaccacaagtaccacacgtggaatcaactagttctctatagcaaataattttattaaatactagctgacccggcagacttcgtagtgccttaatctataaataaaataccgaaacttttgtacaaaataaacttaaaacaaacaaaaggaatccgtccgacgtccggggacacatcaaaggaaaaacaaaattgttatttttatttaattccgagcattttcatatttatctaccttttaaaccttctctggacttccacaaataattcaagaccaaaattagccaaatcggtccagccgttctcgagttttaacgagactaacgaacagcaattcatttttatatatagacattgttgaattttgttaaaatttgcacagttgtccagagaatattgaaaaactgtgtgcttcgtacgaatttttttttttttacgttttcgataatatataagttagctgaaatttgtatggagttggaacgttttcctacgtttgcgctgggggtgctgttccaacttttacattatcgagaacttaaaaaaactcgcgctaagcacactggagacttgagcattcggttgttgttaatgtctacaatgtcttttataaatctatccgaaatattttgtctttcaacggccgtctggtgtagtggtaagtgacattgtcactacctaagggggtcgcgggttcgaatcccgccaagggaagatatttgtatgataaattaatataaaatgtcttttccagggttatggatgtatattaaatatattatgtatgtgtataataaaaatcttacatttatttccgttatccggtacctttaacacaagttctttacgatattatcacgggatcagttaacgtggcgtgattgttagtaaatatttatttattatttattttactcttatctttcacactgagacgcagtccgttctagaataacttagtcatccgtgaccatgaaacttgtaatgcattcgaaccgtcggaaaaagaaaaaaatggacgtgatattaaacagtaaaatgaattttattcgattataaattatgaacgcgaatccgtatgaacgtcgaaaaatagaacaattacgaaactaaaattcttaattacaaattaaattaaaactccttagacttatcaagaaattagaaacatcatttgaattagttaattagaaaataaacggaacacggcattttaattcttaaacatttcagtgacattgctataaatatatatatcgacacttgaaaggcaaaagtgactaagcggcaataactgatttgtacataaatgataggcaataaccatattagatgcgcaaaaaaatatatttctaggtctattaaaatcatttcaatcctacagctacactagaatcta。

44、进一步的，所述基因的调控序列由以下步骤克隆获得：以家蚕f7品种的蚕卵基因组为模板进行扩增，其中正向引物如seq id no:6，5'-tccatgcactaatcataacca-3'，反向引物如seq id no:7，5'-tagattctagtgtagctgtagga-3'。

45、优选的，所述调控序列在显著上调家蚕f7品种bmcare-6基因表达中的应用。

46、以上任一所述家蚕f7品种抗药性bmcare-6基因的合成方法，包括以下步骤：

47、s1、取家蚕f7品种5龄3天的中肠组织，提取总rna，然后以总rna为模板，反转录合成cdna；

48、s2、以cdna为模板合成bmcare-6基因的cds序列，其中cds序列克隆的正向引物如seq id no:4，5'-atgtttgtattattattgcttatctt-3'，反向引物如seq id no:5，5'-tcacctgacttgatcgtctac-3'。

49、以上任一所述bmcare-6基因及其调控序列在作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂的分子标记中的应用。

50、以上任一所述bmcare-6基因及其调控序列在作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂分子育种靶标中的应用。

51、包含以上任一所述bmcare-6基因及其调控序列的表达载体。

52、包含以上所述表达载体的宿主细胞。

53、有益效果：(1)本发明所述家蚕f7品种bmcare-6基因的调控序列，能够显著上调该基因的表达水平；(2)本发明所述家蚕f7品种bmcare-6基因及其调控序列能够作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂的分子标记、或作为分子育种的靶标；(3)包含所述基因及其调控序列的转录元件、表达载体及宿主细胞，甚至是杂合体同样具备bmcare-6基因高表达水平；(4)所述基因及其调控序列从新的角度为农业生产中害虫防治提供指导。