协调大肠杆菌代谢途径高效合成L-丙氨酸的方法

本发明涉及协调大肠杆菌代谢途径高效合成l-丙氨酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术：

1、l-丙氨酸是一种非必需氨基酸，是美国食品药品监督管理局批准的食品添加剂和营养补充剂，被广泛应用于医疗保健行业，还可用作低热量甜味剂和化妆品中的皮肤与头发护理剂等。此外，l-丙氨酸在工业领域也有巨大的应用潜力，其最吸引人的用途是作为生产二羧甲基丙氨酸三钠(mgda)的重要原料之一。mgda是一种新型的绿色螯合剂，具有优异的性能，适用于多种清洁产品，l-丙氨酸成本的降低大大加速了mgda的发展。此外，l-丙氨酸在生产生物可降解和生物相容性聚合物(如聚酯酰胺)和工程热塑性塑料(如聚酰胺)方面也显示出巨大的潜力。

2、大肠杆菌(escherichia coli)营养需求简单，可利用廉价的培养基生长并易获得高密度菌体，具有发酵周期短、发酵产量高和生产强度高等优点。同时，e.coli遗传背景清晰，基因工程操作手段成熟。由于l-丙氨酸对大肠杆菌的生长、代谢有显著的抑制作用，过高浓度的l-丙氨酸会抑制菌体生长及产物合成，发明人前期开发了一种温度控制开关，使菌体生长阶段与l-丙氨酸发酵阶段分步进行，l-丙氨酸产量达到120.3g/l，糖酸转化率为88.3％(appl biochem biotechnol(2016)178:324–337)。通过发酵条件优化，该菌株最高l-丙氨酸产量达到了167.7g/l(重组大肠杆菌利用不同碳源发酵合成l-丙氨酸的方法，2024106218418)，是目前大肠杆菌利用无机盐培养基发酵合成l-丙氨酸的最高产量。但该菌株在发酵过程中产生多种有机酸副产物，如丙酮酸、乙酸、乳酸等，这些副产物的产生会降低发酵合成l-丙氨酸的转化率。为实现l-丙氨酸的工业化生产、解决副产物(尤其是乙酸)含量仍然较高的问题，急需进一步开发新的策略以提升重组菌株l-丙氨酸合成性能。

技术实现思路

1、针对l-丙氨酸合成过程积累副产物的问题，本发明通过探究副产物合成代谢途径、tca循环以及葡萄糖分解代谢产物对l-丙氨酸发酵合成的作用，提供了减少副产物积累、提高l-丙氨酸产量的方法。

2、本发明提供了一种l-丙氨酸生产能力提高的重组大肠杆菌，在出发菌株的基础上具有如下至少一种改进：

3、(1)敲除磷酸转乙酰酶编码基因eutd，降低副产物乙酸的合成；

4、(2)将丙酮酸感应葡萄糖代谢系统整合到染色体上基因mgsa处，通过动态调控葡萄糖摄取途径避免过速代谢，以降低有机酸副产物合成量；所述丙酮酸感应葡萄糖代谢系统为pgex-j23100-sdpdhr-j23101-f9-sgrt，公开于论文《metabolic engineering ofglycolysis in escherichia coli for efficient production of patchoulol andτ-cadinol》中，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

5、(3)在丙酮酸脱氢酶复合物基因lpda后插入das+4降解标签，弱化tca循环流量，提高l-丙氨酸转化率；所述das+4降解标签的编码序列如seq id no.2所示。

6、在一种实施方式中，所述出发菌株为大肠杆菌b0016-060bc，已公开于论文《efficient l-alanine production by a thermo-regulated switch in escherichiacoli》中。

7、在一种实施方式中，基因eutd的核苷酸序列如gene id:946940所示。

8、在一种实施方式中，基因mgsa的核苷酸序列如gene id:945574所示。

9、在一种实施方式中，基因lpda的核苷酸序列如gene id:944854所示。

10、本发明还提供了一种提高l-丙氨酸产量并降低乙酸产量的方法，所述方法是对具有l-丙氨酸生产能力的重组大肠杆菌进行如下至少一种改进：

11、(1)降低磷酸转乙酰酶的表达；

12、(2)将丙酮酸感应葡萄糖代谢系统整合到染色体mgsa处；所述丙酮酸感应葡萄糖代谢系统为pgex-j23100-sdpdhr-j23101-f9-sgrt，公开于论文《metabolic engineeringof glycolysis in escherichia coli for efficient production of patchoulol andτ-cadinol》中，其核苷酸序列如seq id no.3所示；

13、(3)在丙酮酸脱氢酶复合物的lpda基因后插入das+4降解标签；所述das+4降解标签的编码序列如seq id no.2所示。

14、在一种实施方式中，所述降低磷酸转乙酰酶的表达包括但不限于敲除磷酸转乙酰酶编码基因eutd。

15、在一种实施方式中，所述具有l-丙氨酸生产能力的重组大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌b0016-060bc。

16、本发明还提供了应用所述重组大肠杆菌生产l-丙氨酸的方法，是将所述重组大肠杆菌在含有葡萄糖和硫酸铵的m9培养基中，进行好氧-限氧两阶段发酵培养。

17、在一种实施方式中，所述“好氧-限氧两阶段发酵培养”具体是：先在32～34℃有氧环境下培养一段时间，再升温至40～42℃静置培养或不再向发酵体系中供氧继续发酵至结束。

18、在一种实施方式中，好氧发酵阶段控制发酵温度为32～34℃培养至od600达到3.0转为限氧发酵阶段；所述限氧发酵阶段于40～42℃静置培养，该阶段还向培养体系中补料葡萄糖。

19、在一种实施方式中，好氧发酵阶段控制发酵温度为32～34℃、溶氧≥45％，培养至od600达到50，于40～42℃继续培养40～50min转为限氧发酵阶段；所述限氧发酵阶段调整空气通量为0，发酵温度为40～42℃，该阶段还向培养体系中补料葡萄糖并控制葡萄糖浓度≥10g/l。

20、本发明还提供所述重组大肠杆菌或所述方法在生产l-丙氨酸或含l-丙氨酸的产品中的应用。

21、有益效果：

22、(1)本发明通过敲除eutd显著降低大肠杆菌发酵过程中乙酸的合成量，副产物乙酸合成量下降了25.3％。

23、(2)本发明利用丙酮酸感应葡萄糖代谢调控系统，动态调控葡萄糖代谢过程，有效缓解了葡萄糖过速代谢，副产物丙酮酸、琥珀酸、乳酸在发酵过程中的积累量显著降低，且l-丙氨酸产量提升了8.9％，达到183g/l。

24、(3)本发明通过在丙酮酸脱氢酶复合物lpda基因尾端插入das+4自降解标签，降低丙酮酸流向tca循环的通量，降低了菌体生长阶段的氧需求量并间接提升菌体在限氧阶段活性，l-丙氨酸产量进一步提升了6.9％达到195.2g/l。

1.一种l-丙氨酸生产能力提高且副产物积累量降低的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上具有如下至少一种改进：

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌b0016-060bc。

3.根据权利要求1或2任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，基因eutd的核苷酸序列如gene id:946940所示；基因mgsa的核苷酸序列如gene id:945574所示；基因lpda的核苷酸序列如gene id:944854所示。

4.一种提高大肠杆菌l-丙氨酸产量并降低乙酸产量的方法，其特征在于，对具有l-丙氨酸生产能力的重组大肠杆菌进行如下至少一种改进：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述降低磷酸转乙酰酶的表达包括但不限于敲除磷酸转乙酰酶编码基因eutd。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有l-丙氨酸生产能力的重组大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌b0016-060bc。

7.根据权利要求4～6任一所述的方法，其特征在于，基因eutd的核苷酸序列如geneid:946940所示；基因mgsa的核苷酸序列如gene id:945574所示；基因lpda的核苷酸序列如gene id:944854所示。

8.一种发酵生产l-丙氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌在含有葡萄糖和硫酸铵的m9培养基中，进行好氧-限氧两阶段发酵培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述好氧-限氧两阶段发酵培养是在(a)或(b)的条件下发酵：

10.权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌或权利要求8～9任一所述方法在生产l-丙氨酸或含l-丙氨酸的产品中的应用。