一种根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法

1.一种根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤1）中，叶片外植体取材要求：取杜梨壮苗培养15-25 d后的幼嫩且厚实叶片，沿叶中脉垂直方向切断叶中脉至一侧叶边缘，获得叶片外植体；叶柄外植体的取材要求：切去叶柄基部后切成0.5-1 cm小段，获得叶柄外植体；所述壮苗培养基为ms+0.5 mg/l 6-ba+0.01 mg/lnaa+30 g/l 蔗糖+6.5 mg/l 琼脂粉，ph5.8。

3.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤2）和3）中，所述脱分化培养基为：ms+0.5 mg/l tdz+0.1 mg/l naa+0.1 mg/l iba+0.5 mg/l iaa+0.5 mg/l zt +1 mg/l fa+150 mg/l椰汁+30 g/l 蔗糖+6.5 g/l琼脂粉，ph5.8。

4.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤5）中，将3-6 g嫩叶置于灭菌研钵中，加入8-15 ml研磨液研磨成汁，再加入40-60 mg/l as研磨混匀后，备用；所述矮牵牛增殖培养基为：ms+0.01 mg/l naa+30 g/l蔗糖+6.5 mg/l琼脂粉；所述研磨液为1/2 ms液体培养基。

5.如权利要求3所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤6）中，侵染叶片时，侵染菌液中加入0.001-0.004%表面活性剂l-77；侵染叶柄时，侵染菌液中加入0.01-0.04%表面活性剂l-77；所述共培养基为：脱分化培养基+50 mg/l as。

6.如权利要求3所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述选择培养脱分化培养阶段具体为：将除菌清洗过的共培养外植体转入含20-50mg/l kan和200-300 mg/l cef的脱分化培养基中，置于25±3℃暗培养25-35 d后，更换一次培养基，继续置于25±3℃、16 h光照/8 h弱光培养25-35 d，光照强度10-20 μmol·m2·s-1。

7.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述选择培养再分化培养阶段具体为：将完成选择培养脱分化培养阶段的外植体转入含20-50 mg/l kan和200-300 mg/l cef的再分化培养基中，置于25±3℃、16 h光照/8 h黑暗培养，光照强度20-40 μmol·m2·s-1，培养至长出再生芽，每25-35 d更换一次培养基；所述再分化培养基为：ms+ 5 mg/l 6-ba+0.05 mg/l iba+1 mg/l fa+1 mg/l zt+30 g/l蔗糖+6.5 g/l 琼脂粉，ph5.8。

8.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述增殖培养具体为：将长至1-2 cm、具有完整茎结构的再生芽，沿茎基部从外植体上切下，获得单株抗性株系，转至含350-450 mg/l cef的增殖培养基中培养；所述增殖培养基为：ms+0.5 mg/l 6-ba+0.01 mg/l naa+30 g/l 蔗糖+150 ml椰汁+6.5 mg/l 琼脂粉，ph5.8。

9.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述生根培养具体为：每个株系取3-5个长至2-3 cm的植株，沿茎基部从外植体上切下，转至含350-450 mg/l cef的生根培养基中培养；所述生根培养基为：ms+0.2 mg/l iba+30 g/l蔗糖+6.5 mg/l琼脂粉，ph5.8。

10.如权利要求1所述根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤7）中，所述炼苗移栽具体为：将生根苗取出，自来水冲洗干净根部培养基，移栽至营养土中，覆膜10-20 μmol·m2·s-1弱光培养7-10 d后，揭膜并转入100~200 μmol·m2·s-1正常光培养；在移栽20-40 d后浇水溶复合肥，促进移栽苗生长。