用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标志物及基因检测试剂盒

本发明涉及分子生物学，具体是一种用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标志物及基因检测试剂盒。

背景技术：

1、现甲状腺结节的诊断主要基于“甲状腺彩超联合彩超引导下的细针抽吸活检(fine needle aspiration cytology，fnac)”，对于上述检查不能明确的甲状腺结节(不确定性甲状腺结节)则考虑使用多基因检测工具进一步明确诊断(基于ata甲状腺结节诊断指南)。当前多基因检测工具主要是国外基于ngs平台研发的“rna-gec”和“dnav3”，该检测工具能使甲状腺结节诊断的灵敏度达到93％，特异性达到81％，阳性预测值达到68％，阴性预测值达到97％，准确率达到85％。

2、上述检测手段主要应用于不确定性甲状腺结节的诊断，主要原理是基于甲状腺癌组织与正常甲状腺组织的dna及rna差异，基本ngs技术对fna样本进行甲状腺癌相关基因检测，将新鲜的fna样本储存在保存液中，采用micro-rna和dna共提取技术提取组织中的rna和dna。对提取的rna和dna进行定性分析，构建测序文库，利用life technologytm s5测序仪进行检测、数据分析和综合数据质量控制分析，获得样品的突变信息(dna突变和rna融合)，筛选特异突变进而根据基因突变判断结节的良恶性。

3、专利申请号cn 202210502980.x公开了一种用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用。所述生物标志物组包含8种dna单碱基突变和4种基因融合中的至少一种；所述8种dna单碱基突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、kras基因g12c/g12v/q61r、nras基因q61r、hras基因q61r，所述4种基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)、ncoa4-ret(exon8-exon12)、pax8-pparg(exon10-exon2)、etv6-ntrk3(exon4-exon14)。专利申请号cn 202111162079.4公开了一种甲状腺癌辅助诊断和用药指导的检测试剂盒，由外显子区域和tert启动子区域检测组合组成；外显子区域为b r a f、dicer1、hras、idh2、kras、nras、pik3ca、ret、tp53外显子区域；该检测试剂盒能够检测10个基因。专利申请号cn 201910592171.0公开了一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物及试剂盒，可以同时检测6个基因的15个位点的变异以及3个融合基因变异，其中包括braf基因、kras基因、hras基因、nras基因、tert基因、eif1ax基因和ret/ptc1融合、ret/ptc3融合、pax8/pparγ融合。专利申请号cn 201811634541.4公开了一种基于高通量测序技术用于检测甲状腺癌致病相关基因变异的试剂盒。包括对braf、nras、kras、hras、tert、tp53 6个基因的18个突变位点和ccdc6/ret、ncoa4/ret、pax8/pparg 3个融合基因进行检测。专利申请号cn 201680082789.7公开了一种用于筛选甲状腺癌中突变的组合物，多个甲状腺癌相关基因包括braf、nras、hras、kras、pik3ca、tp53、ctnnb1、pten、tshr、akt1、gnas、ret、eif1ax和tert启动子。这些检测试剂盒中检测了过多无诊断价值的基因、价格昂贵。以上方案只能针对已知热点进行扩增检测，对于未知突变则存在漏检的风险，或者是基于ngs检测的大panel检测方案，因检测区域太大，未针对甲状腺良恶性判断进行筛选的基因组合。造成测序数据浪费，推高检测成本且效率低。

4、综上，现有甲状腺结节多基因检测试剂盒仅针对不确定性甲状腺结节进行良恶性鉴别、价格昂贵不具备经济普适性、检测过多无诊断价值基因，不能满足当前行业需求。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供了一种检测成本低、基因更聚焦、兼容未知突变的用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标志物及基因检测试剂盒。实现了对待测基因更聚焦，兼容未知突变，精减待测靶基因同时降低了检测成本，数据更精中，分析流程更简化高效，为该检测普及奠定了基础。

2、发明人在工作中发现“braf v600e”，“ret”，“hras”,”kras”,“ntrk3”这5个基因已经可以判断甲状腺结节良恶性。

3、鉴于此，本发明采用的技术方案是：用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标志物，包括至少一种基因突变检测位点：braf v600e、kras q61k、kras q61r、kras g13v、hrasq61k、hras q61r、hras g13r；或/和至少一种基因融合检测位点：ret-ccdc6，ret-ncoa4，ntrk3-etv6。

4、本发明还包括生物标志物在制备甲状腺结节良恶性鉴别诊断产品中的用途。

5、本发明还提供生物标志物在制备甲状腺结节良恶性鉴别所用捕获探针的用途。

6、进一步，所述捕获探针采用叠瓦式探针设计，所述探针对生物标志物中基因区域的覆盖度达100％，覆盖基因中cds区和内含子区。

7、进一步，所述探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；所述的外显子和内含子拼接处是指外显子上下游至少各10-100个bp。

8、本发明再次提供了用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的基因检测试剂盒，包括述捕获探针。

9、进一步，还包括核酸抽提试剂盒、文库构建试剂盒、杂交捕获试剂盒、测序试剂盒。

10、进一步，所述核酸抽提试剂盒包括dna打断酶、末修&补a酶、dna连接酶、聚合酶、缓冲液；所述文库构建试剂盒包括index引物；所述杂交捕获试剂盒包括human cot-1 dna、封闭接头序列、捕获探针；所述测序试剂盒包括纯化磁珠、链霉亲和素磁珠。具体如下表所示：

11、

12、本发明最后提供了所述基因检测试剂盒在构建甲状腺结节良恶性鉴别诊断系统中的应用。所述甲状腺结节良恶性鉴别诊断系统包括测序仪。

13、国内每年甲状腺癌发病人数达20万以上，且发病率呈逐年增高的趋势。目前甲状腺肿瘤良恶性鉴别主要采用fna细胞学检测的方式，然而该方法因诊断机构、细胞病理医师的经验和能力的差别而有所不同，在实际应用中，有15％-40％“滤泡性肿瘤”或“可疑滤泡性肿瘤”的病变实际为恶性。本发明采用了多基因检测的方式，保证了热点基因的全覆盖，在严格控制测序范围及成本的情况下，有效提高了最终诊断率。本发明的试剂盒覆盖了热点检测基因的同时还检测出了kras q61k、hras q61k，避免了漏检情况。

1.用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的生物标志物，其特征在于：包括至少一种以下基因突变检测位点：braf v600e、kras q61k、kras q61r、kras g13v、hras q61k、hras q61r、hras g13r；

2.权利要求1所述生物标志物在制备甲状腺结节良恶性鉴别诊断产品中的用途。

3.权利要求1所述生物标志物在制备甲状腺结节良恶性鉴别所用捕获探针中的用途。

4.根据权利要求3所述用途，其特征在于：所述捕获探针采用叠瓦式探针设计，所述探针对生物标志物中基因区域的覆盖度达100％，覆盖基因中cds区和内含子区。

5.根据权利要求3或4所述用途，其特征在于：所述探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；所述的外显子和内含子拼接处是指外显子上下游至少各10-100个bp。

6.用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的基因检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求3-5任一项所述捕获探针。

7.根据权利要求6所述基因检测试剂盒，其特征在于：还包括核酸抽提试剂盒、文库构建试剂盒、杂交捕获试剂盒、测序试剂盒。

8.根据权利要求7所述基因检测试剂盒，其特征在于：所述核酸抽提试剂盒包括dna打断酶、末修&补a酶、dna连接酶、聚合酶、缓冲液；所述文库构建试剂盒包括index引物；所述杂交捕获试剂盒包括human cot-1 dna、封闭接头序列、捕获探针；所述测序试剂盒包括纯化磁珠、链霉亲和素磁珠。

9.权利要求6-8任一项所述基因检测试剂盒在构建甲状腺结节良恶性鉴别诊断系统中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述甲状腺结节良恶性鉴别诊断系统包括测序仪。