以红托竹荪子实体为原料的DNA提取方法与流程

本发明涉及红托竹荪种植，特别是一种以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法。

背景技术：

1、红托竹荪（ phallus rubrovolvatus）隶属于真菌界、担子菌门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、鬼笔属，又名竹笙、竹花，是一种风味独特、营养丰富的名贵食药兼用菌，分布于云南、贵州、四川、广东等地。我国是最早食用和栽培竹荪的国家，目前已实现红托竹荪人工规模化栽培，且产业不断壮大，栽培前景广阔。

2、获得高质量dna样品，是进行红托竹荪分子生物学研究的基础，获得高质量dna样品后可进一步解析红托竹荪生长发育规律、遗传性状、系统分类地位，解决分子辅助育种等问题。

3、然而，在进行红托竹荪dna样品提取过程中，提取原料存在以下问题：

4、1、若采用红托竹荪菌丝进行提取，则需对菌丝进行培养，培养过程中菌丝易老化变红，往往要经过漫长的培养时间，并准备大量的培养皿菌丝，才能获得满足dna提取需要的菌丝量，工作量大且不易获得理想物料进行提取。

5、2、若采用红托竹荪子实体进行提取，虽然子实体作为提取材料便于采集且起始原料量大，但由于红托竹荪子实体细胞内富含多糖、胶质与色素等多种杂质，这些杂质会严重影响dna提取结果准确性，且这些杂质难以在不破坏dna的情况下实现分离。

6、笔者研究团队在前期使用ctab法、试剂盒法等对红托竹荪子实体进行dna提取，所获dna样品存在dna浓度低、dna片段短的问题，采用琼脂糖凝胶电泳处理样本无法得到清晰完整的条带，致使测序建库失败，无法满足后续实验与分析的需求，严重影响科研结论的完整性和正确性。

7、为在最短时间内完成红托竹荪dna样品提取并满足后续实验分析，解决无法从子实体中提取高质量dna样品的问题，

8、现有菌株dna提取方法如cn 201610163675.7中公开的真菌菌丝总dna提取液及提取真菌菌丝总dna的方法，包括：提取液i和提取液ii，提取液i包括：缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其ph值为7.5-8.5；提取液ii包括：缓冲盐和阳离子表面活性剂，其ph值为7.5-8.5。效果：1）简化了总dna提取步骤；2）适用于总dna微量提取；3）避免了有毒有机溶剂的使用；4）可以简化操作步骤和时间；5）还避免了液氮研磨过程中容易造成冻伤皮肤的可能性。但该方法中所用阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂存在生物毒性，会破坏提取dna导致dna片段短的问题。

9、又如cn201210349441.3中公开的军团菌dna提取试剂盒及提取军团菌dna的方法，该方法通过叠氮钠、chelex-100溶液，使标本中的蛋白质变性，在蛋白酶k充分消化作用后，通过chelex-100将非核酸有机物螯合，再离心除去chelex颗粒，使其它杂质与dna分离，从而将上清dna溶解在三羟甲基氨甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸溶液中，dna得以纯化回收。该方法处理时间短，效率高，可快速同时处理多个样本，获得适合后续分子生物学分析的dna样品。但该方法不使用于处理红托竹荪样本并提取dna。

10、且现有文献中未见将溶壁酶和纤维素酶的混合酶溶液用于处理红托竹荪样本提取dna。

11、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明针对上述技术问题提供了一种以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，该方法适用于红托竹荪子实体，能减少红托竹荪子实体中所含各类杂质对dna片段的不良影响，提高提取所得dna片段的长度、增加提取所得dna浓度。

2、本发明提供了一种以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，包括以下步骤：

3、1）取红托竹荪子实体组织与含溶壁酶、纤维素酶的混合酶溶液，混合、研磨、冰面上消化后，加入去多糖buffer冰浴后离心，加入65℃下预热的4×ctab裂解液、20mg/ml蛋白酶k溶液混匀后65℃水浴10~15h，得到第一溶液；

4、2）在第一溶液中加入3mol/l浓度的醋酸钾溶液涡旋混匀，冰浴20~30min后，恢复至室温后加入由酚、氯仿、异戊醇组成的混合溶剂，室温摇匀10~15h后，离心10~15min取上清液加入与上清液等体积的由氯仿、异戊醇组成混合溶液，室温摇匀10~15h后，离心10~15min取上清液，得到最终上清液；

5、3）在最终上清液中加入最终上清液二倍体积异丙醇混匀，置于-20~-18℃环境下20~30min后离心10~15min弃上清后，洗涤、离心再弃上清后，烘干得到干燥dna。

6、优选地，含溶壁酶、纤维素酶的混合酶溶液由2~2.5%溶壁酶、2~2.5%纤维素酶组成。

7、优选地，消化为在30~32℃、摇摆频率为180~200rpm下消化10~15h。

8、优选地，添加蛋白酶k溶液后水浴时每隔25~35min摇匀一次溶液。

9、优选地，由酚、氯仿、异戊醇组成的混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇按体积比为25：24：1混合得到。

10、优选地，由氯仿、异戊醇组成混合溶液为氯仿、异戊醇按体积比为24：1混合得到。

11、优选地，异丙醇在使用前在-20℃下预冷处理。

12、优选地，还包括：采用干燥dna配制dna溶液的操作；该操作为将干燥dna溶解于预热过的无菌ddh2o中，加入10mg/ml浓度的rnasea溶液后37℃下水浴30~35min得到dna溶液。

13、优选地，洗涤为用75%的乙醇洗涤。

14、本发明能产生的有益效果包括：

15、1）本发明所提供的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，该方法处理红托竹荪子实体为原料能提取得到清晰完整条带的dna片段，有效提升红托竹荪子实体提取dna的得率及片段长度。同时以红托竹荪子实体为原料更易获取原料，而且提取原料起始量大，有效节省菌丝培养时间，避免菌丝在培养过程中变红、老化、性质不稳定的问题。采用该方法所得dna片段琼脂糖凝胶电泳检测中可得明亮条带，说明所提取dna满足后续各项检测所需质量要求。

16、2）本发明所提供的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，该方法中可有效水解细胞壁中所含的葡聚糖等物质中的多聚β1→3糖苷键，从而减少细胞壁对dna提取的不良影响，脱壁后，红托竹荪的完整遗传物质dna得以完全暴露。该方法还能在裂解细胞壁过程中可有效保护dna及原生质体，有效保护dna片段长度和浓度。该方法提取红托竹荪子实体的dna浓度与片段长度都明显优于ctab法提取出的dna，可满足后续实验要求，为红托竹荪分子生物学研究的顺利开展奠定基础。

1.一种以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，含溶壁酶、纤维素酶的混合酶溶液由2~2.5%溶壁酶、2~2.5%纤维素酶组成。

3.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，消化为在30~32℃、摇摆频率为180~200rpm下消化10~15h。

4.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，添加蛋白酶k溶液后水浴时每隔25~35min摇匀一次溶液。

5.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，由酚、氯仿、异戊醇组成的混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇按体积比为25：24：1混合得到。

6.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，由氯仿、异戊醇组成混合溶液为氯仿、异戊醇按体积比为24：1混合得到。

7.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，异丙醇在使用前在-20℃下预冷处理。

8.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，还包括：采用干燥dna配制dna溶液的操作；该操作为将干燥dna溶解于预热过的无菌ddh2o中，加入10mg/ml浓度的rnasea溶液后37℃下水浴30~35min得到dna溶液。

9.根据权利要求1所述的以红托竹荪子实体为原料的dna提取方法，其特征在于，洗涤为用75%的乙醇洗涤。