一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法和试剂盒与流程

本发明属于生物，特别是涉及一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法和试剂盒。

背景技术：

1、突触体相关蛋白25 kda(synaptosome-associated protein of 25 kda，snap25)是由oyler等人首次鉴定的25 kda（206个氨基酸）螺旋蛋白。它由两种亚型snap25a和snap25b组成，并且分别出现在神经发育的不同阶段。在结构上，snap25是一个螺旋蛋白，两个α-螺旋的snap25和另外两个螺旋囊泡相关膜蛋白(vesicle-associated membraneprotein，vamp)和突触融合蛋白(syntaxin，stx)共同组成可溶性n-乙酰-马来酰胺-敏感因子-附着蛋白受体(soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment proteinreceptor，snare)复合物。功能上，snap25参与突触前神经递质的释放。并且，残基180-197在钙动力学调节中起到关键作用。此外，snap25的c端拉链也被发现引发了snare复合物的融合孔开放和构象变化。

2、肉毒毒素(botulinum toxins，bonts)是一种神经毒素多肽，其为已知对人类毒性最强的天然蛋白质毒素，对人的半数致死量为0.1-1.0 ng/kg。肉毒毒素包括bont/a、bont/c和bont/e。bonts进入细胞后通过裂解snare蛋白来阻断神经肌肉连接处神经递质的释放，最终导致松驰型神经麻痹。因此，bonts被广泛用作治疗神经系统相关疾病及美容行业，如慢性偏头痛、三叉神经痛、面肌痉挛、肌张力障碍等、膀胱过度活动症、眉间纹等。

3、目前商业化的snap25抗体常被用来检测肉毒毒素的生物活性。但多数snap25抗体为动物源（包括鼠源、兔源）的多克隆或单克隆抗体。动物源单克隆抗体是通过杂交瘤技术生产，需要经过动物免疫、复杂的杂交瘤融合及筛选等过程，整个周期的时间较长，重复生产性能差。

4、因此，目前仍需筛选周期短、重复生产性能优异且亲和力高的用来检测肉毒毒素活性的全人源抗体。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术中的至少部分问题，本发明从抗体文库筛选得到抗hsnap25人源单链抗体，通过基因工程技术构建出真核表达载体，在真核细胞中进行表达，并转变为特异性全人源完整的hsnap25-igg1抗体，再对其进行分离纯化，对其特异性和亲和力等生物特性进行评价，建立了检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法，所述方法包括使待测样品与抗体或其抗原结合片段接触的步骤，所述抗体或其抗原结合片段靶向突触体相关蛋白或其裂解片段。

3、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链抗原互补决定区cdr h1-h3和/或轻链抗原互补决定区cdr l1-l3，其中，重链抗原互补决定区cdr h1-h3分别具有seq id no.1-3所示的序列，轻链抗原互补决定区cdr l1-l3分别具有seq id no.4-6所示的序列。

4、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述肉毒毒素包括bont/a、bont/c和/或bont/e。

5、本发明的第二方面，提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链抗原互补决定区cdr h1-h3和/或轻链抗原互补决定区cdr l1-l3，其中，重链抗原互补决定区cdr h1-h3分别具有seq id no.1-3所示的序列，轻链抗原互补决定区cdr l1-l3分别具有seq id no.4-6所示的序列。

6、在某些实施方案中，根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有以下所示的任意一种氨基酸序列：

7、(i) seq id no.7所示的重链氨基酸序列和/或seq id no.8所示的轻链氨基酸序列；

8、(ii) 与(i)所示的氨基酸序列具有至少90％同源性且具有相同功能的氨基酸序列；和

9、(iii) 与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且具有相同功能的氨基酸序列。

10、本发明的第三方面，提供核酸分子，所述核酸分子包含编码根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

11、本发明的第四方面，提供载体分子，所述载体分子包含本发明所述的核酸分子。

12、本发明的第五方面，提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明所述的核酸分子或载体分子。

13、本发明的第六方面，提供根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段通过人工合成或基因工程方式制备。

14、本发明的第七方面，提供一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。

15、本发明的抗突触体相关蛋白抗体的亲和力高于市售的兔突触体相关蛋白多克隆抗体，且具有筛选周期短、重复生产性能优异等优点。

1. 一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括序列如seq id no.1-3所示的重链抗原互补决定区cdr h1-h3和/或序列如seq id no.4-6所示的轻链抗原互补决定区cdrl1-l3。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括另外的抗体，所述另外的抗体用于结合经肉毒毒素切割或裂解的突触体相关蛋白的片段。

3. 一种检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括使待测样品与抗体或其抗原结合片段接触的步骤，所述抗体或其抗原结合片段包括重链抗原互补决定区cdr h1-h3和/或轻链抗原互补决定区cdr l1-l3，其中，重链抗原互补决定区cdrh1-h3分别具有seq id no.1-3所示的序列，轻链抗原互补决定区cdr l1-l3分别具有seqid no.4-6所示的序列。

4.根据权利要求3所述的检测肉毒毒素活性或突触体相关蛋白的方法，其特征在于，所述肉毒毒素包括bont/a、bont/c和/或bont/e。

5. 抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链抗原互补决定区cdr h1-h3和/或轻链抗原互补决定区cdr l1-l3，其中，重链抗原互补决定区cdrh1-h3分别具有seq id no.1-3所示的序列，轻链抗原互补决定区cdr l1-l3分别具有seqid no.4-6所示的序列。

6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有以下所示的任意一种氨基酸序列：

7.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码根据权利要求5或6所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

8.载体分子，其特征在于，所述载体分子包含根据权利要求7所述的核酸分子。

9.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含根据权利要求7所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体分子。

10.根据权利要求5或6所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段通过人工合成或基因工程方式制备。