一种分离的转座酶及其用途的制作方法

1.一种分离的转座酶，其中所述转座酶具有选自下述(i)的转座酶序列或(ii)-(iv)中的具有转座酶活性的前述转座酶的变体序列：

2.根据权利要求1所述的转座酶，其中所述转座酶具有选自下述组(1)-(8)中至少一组的转座酶序列：

3.一种分离的转座酶，其中所述转座酶包含式(i)所示的氨基酸序列：

4.一种分离的转座酶，其中所述转座酶包含式(ii)所示的氨基酸序列：

5.一种分离的转座酶，其中所述转座酶包含式(iii)所示的氨基酸序列：

6.一种分离的转座酶，其中所述转座酶包含式(i)、式(ii)和式(iii)所示的氨基酸序列中的至少两个。

7.一种分离的转座酶，其中所述转座酶包含式(i)、式(ii)和式(iii)所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的转座酶，其中式(i)和式(ii)相隔80至120个氨基酸，式(ii)和式(iii)相隔20至40个氨基酸。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的转座酶，其中所述转座酶属于tc1/mariner超家族。

10.根据权利要求9所述的转座酶，其中所述转座酶属于tc1、tc2、tc4、mariner、tigger、pogo、fot1、isrm11、或m44家族。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的转座酶，其中所述转座酶的物种来源包括节肢动物门、脊索动物门、刺胞动物门、软体动物门、或扁虫动物门。

12.根据权利要求11所述的转座酶，其中所述转座酶的物种来源包括昆虫纲、辐鳍鱼纲、两栖纲、软甲纲、蛛形纲、软骨鱼纲、蜥形纲、双壳纲、海鞘纲、水螅纲、或涡虫纲。

13.根据权利要求12所述的转座酶，其中所述转座酶的物种来源包括麦蝽(aeliaacuminata)、叩甲科(agrypnus murinus)、圆颌北梭鱼(albula glossodonta)、棘背钝头鳐(amblyraja radiata)、棉铃象甲(anthonomus grandis)、美妊丽鱼(astatotilapiacalliptera)、德国小蠊(blattella germanica)、中华蟾蜍(bufo gargarizans)、金鱼(carassius auratus)、红九棘鲈(cephalopholis sonnerati)、华丽尾蜂(cercerisrybyensis)、波纹唇鱼(cheilinus undulatus)、绿海龟(chelonia mydas)、竹节虫(clitarchus hookeri)、太平洋牡蛎(crassostrea gigas)、驼背鲈(cromileptesaltivelis)、锦鲤(cyprinus carpio)、斑马鱼(danio rerio)、嗜凤梨果蝇(drosophilaananassae)、嗜食果蝇(drosophila mojavensis)、中华豆芫菁(epicauta chinensis)、白符(folsomia candida)、北方蚁杂交秃背林蚁(formica aquilonia x formicapolyctena)、三刺鱼(gasterosteus aculeatus)、五斑角胫叶甲(gonioctenaquinquepunctata)、普通膜腹寄蝇(gymnosoma rotundatum)、跳镰猛蚁(harpegnathossaltator)、似威氏半鲿(hemibagrus wyckioides)、神枪手叶蝉(homalodiscavitripennis)、水螅(hydra vulgaris)、长叶异痣蟌(ischnura elegans)、太平洋小眼月鱼(lampris incognitus)、白杨飞蛾(laothoe populi)、矛尾鱼(latimeria chalumnae)、刺须细步甲(leistus spinibarbis)、霸王莲花青螺(lottia gigantea)、油橄榄(oleaeuropaea subsp.europaea)、古毒蛾(orgyia antiqua)、夏威夷明钩虾(parhyalehawaiensis)、莫希黄金龙王鲷(petrochromis sp.'moshiyellow')ab-2019、牧草长沫蝉(philaenus spumarius)、灰纹翅尺蛾(philereme vetulata)、栎树猝死病菌(phytophthora ramorum)、长足胡蜂(polistes metricus)、豹蛙(rana pipiens)、巨型海蟾蜍(rhinella marina)、长红锥蝽(rhodnius prolixus)、大西洋鲑(salmo salar)、地中海涡虫(schmidtea mediterranea)、山地隧蜂(seladonia tumulorum)、蜂型透翅蛾(sesiaapiformis)、米象(sitophilus oryzae)、入侵红火蚁(solenopsis invicta)、亚马逊海蟾鱼(thalassophryne amazonica)、寄蝇科(thecocarcelia acutangulata)、茴鱼(thymallus thymallus)、赤拟谷盗(tribolium castaneum)、莫蜢科(vandiemenellaviatica)、或茂物线果蝇(zaprionus bogoriensis)。

14.一种核酸，其中所述核酸编码根据权利要求1-13中任一项所述的转座酶。

15.一种核酸构建体，其包含根据权利要求14所述的核酸，还包含启动子。

16.根据权利要求15所述的核酸构建体，其中所述启动子包括cmv、ef1a、sv40、pgk、ubc、人β肌动蛋白、cag、tre、uas、ac5、gfap、多角体蛋白启动子、tbg、alb、apoehcr-haat、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、ptac、或pl。

17.根据权利要求15所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含poly(a)序列。

18.一种核酸组，其包含5’识别序列，其中所述5’识别序列包含seq id no:80-158所示的核苷酸序列中的至少一个。

19.一种核酸组，其包含3’识别序列，其中所述3’识别序列包含seq id no:159-237所示的核苷酸序列中的至少一个。

20.一种核酸组，其包含5’识别序列和3’识别序列，其中所述5’识别序列包含seq idno:80-158中任一个所示的核苷酸序列或其变体，所述3’识别序列包含seq id no:159-237中任一个所示的核苷酸序列或其变体，并且所述核酸组能被特定的转座酶所识别。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的核酸组，其中所述5’识别序列或所述3’识别序列包含末端反向重复序列。

22.根据权利要求21所述的核酸组，其中所述末端反向重复序列的长度为1-1200nt、1-800nt、1-600nt、1-400nt、1-200nt、1-100nt、5-80nt、10-70nt、20-60nt、20-700nt、50-600nt、100-500nt、150-400nt、150-300nt、或200-260nt中的至少一种。

23.一种核酸组构建体，其包含根据权利要求18-22中任一项所述的核酸组，还包含外源核酸片段。

24.根据权利要求23所述的核酸组构建体，其中所述外源核酸片段通过多克隆插入位点可操作地插入到所述核酸组构建体中，所述外源核酸片段可以有一个或多个，可以相同或不同；还可以插入启动子控制所述外源核酸片段的表达。

25.根据权利要求24所述的核酸组构建体，其中所述外源核酸片段包括感兴趣的任何基因或任何能够被转座的基因，例如天然功能蛋白基因、人工嵌合基因、或非编码rna基因。

26.根据权利要求25所述的核酸组构建体，其中所述天然功能蛋白基因包括基于荧光的报告基因、荧光素酶基因、和抗性基因。

27.根据权利要求26所述的核酸组构建体，其中所述基于荧光的报告基因选自编码绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或黄色荧光蛋白的基因中的至少一种。

28.根据权利要求26所述的核酸组构建体，其中所述荧光素酶基因选自编码萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶的基因中的至少一种。

29.根据权利要求26所述的核酸组构建体，其中所述抗性基因选自编码嘌呤霉素抗性、g418抗性、卡那霉素抗性、四环素抗性或博来霉素抗性的基因中的至少一种。

30.根据权利要求25所述的核酸组构建体，其中所述人工嵌合基因包括嵌合抗原受体基因。

31.根据权利要求24所述的核酸组构建体，其中所述启动子包括cmv、ef1a、sv40、pgk、ubc、人β肌动蛋白、cag、tre、uas、ac5、gfap、多角体蛋白启动子、tbg、alb、apoehcr-haat、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、ptac、或pl。

32.一种组合物，其中所述组合物包含：

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述组合物选自下述组(1)-(80)中的至少一组，下述组(1)-(79)中的任一组包含：转座酶相关序列和核酸组，

34.根据权利要求32-33中任一项所述的组合物，其中所述核酸组还包含启动子。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述启动子包括cmv、ef1a、sv40、pgk、ubc、人β肌动蛋白、cag、tre、uas、ac5、gfap、多角体蛋白启动子、tbg、alb、apoehcr-haat、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、ptac、或pl。

36.根据权利要求32-33中任一项所述的组合物，其中所述核酸组还包含poly(a)序列。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的组合物，其中所述核酸组还包含外源核酸片段。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述外源核酸片段通过多克隆插入位点可操作地插入到所述核酸组中，所述外源核酸片段可以有一个或多个，可以相同或不同；还可以插入启动子控制所述外源核酸片段的表达。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述外源核酸片段包括感兴趣的任何基因或任何能够被转座的基因，例如天然功能蛋白基因、人工嵌合基因、或非编码rna基因。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述天然功能蛋白基因包括基于荧光的报告基因、荧光素酶基因、或抗性基因。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述基于荧光的报告基因包括编码绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、或黄色荧光蛋白的基因。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述荧光素酶基因包括编码萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶的基因。

43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述抗性基因包括编码嘌呤霉素抗性、g418抗性、卡那霉素抗性、四环素抗性、或博来霉素抗性的基因。

44.根据权利要求39所述的组合物，其中所述人工嵌合基因包括嵌合抗原受体基因。

45.根据权利要求38所述的组合物，其中所述启动子包括cmv、ef1a、sv40、pgk、ubc、人β肌动蛋白、cag、tre、uas、ac5、gfap、多角体蛋白启动子、tbg、alb、apoehcr-haat、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、ptac、或pl。

46.一种重组载体，其中所述重组载体包含编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、或根据权利要求32-45中任一项所述的组合物。

47.根据权利要求46所述的重组载体，其中所述重组载体包括重组克隆载体、重组真核表达质粒、或重组病毒载体。

48.根据权利要求47所述的重组载体，其中所述重组真核表达质粒包括pcdna3.1、pcmv、puc18、puc19、puc57、pbad、pet、pentr、pgenlenti、或paav。

49.根据权利要求47所述的重组载体，其中所述重组病毒载体包括重组腺病毒载体、重组腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、或重组痘苗病毒载体。

50.一种重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、或根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体。

51.根据权利要求50所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包括动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞。

52.根据权利要求51所述的重组宿主细胞，其中所述动物细胞包括哺乳动物细胞。

53.根据权利要求52所述的重组宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞包括原代细胞(例如间充质干细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、和免疫细胞)、永生化细胞系(例如hek293、nih-3t3、raw-264.7、sto、vero、ct26、htert永生化的人内皮/上皮/成纤维/角质/导管/细胞系)、癌细胞系(例如hela、hepg2/3、hl-60、ht-1080、ht-29、a549、sw620、hct-15、hct116、mda-mb-231、mcf7、sk-ov-3、panc-1、aspc-1、thp-1、huh7、kg-1、raji、hb-cb、jurkat、k562、crl5826、cho、mdck、renca)、胚胎干细胞系(例如h1、h9、wibr2、wibr3、g-olig2、esf158、rw.4、r1、d3)及其分化的细胞、或诱导多能干细胞系及其分化的细胞。

54.一种将外源核酸片段引入宿主细胞基因组的方法，其中所述方法包括：将根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、或根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体递送进宿主细胞。

55.一种对宿主细胞基因组进行编辑的方法，其中所述方法包括：将根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、或根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体递送进宿主细胞。

56.一种获得基因组中包含外源核酸片段的宿主细胞的方法，其中所述方法包括：将根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、或根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体递送进宿主细胞。

57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述递送方法包括阳离子脂质体递送、类脂纳米粒递送、阳离子聚合物递送、囊泡-外泌体递送、金纳米粒递送、多肽及蛋白递送、逆转录病毒递送、慢病毒递送、腺病毒递送、腺相关病毒递送、电穿孔、农杆菌侵染、或基因枪。

58.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包括动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述宿主细胞包括原代细胞(例如间充质干细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、免疫细胞)、永生化细胞系(例如hek293、nih-3t3、raw-264.7、sto、vero、ct26、htert永生化的人内皮/上皮/成纤维/角质/导管/细胞系)、癌细胞系(例如hela、hepg2/3、hl-60、ht-1080、ht-29、a549、sw620、hct-15、hct116、mda-mb-231、mcf7、sk-ov-3、panc-1、aspc-1、thp-1、huh7、kg-1、raji、hb-cb、jurkat、k562、crl5826、cho、mdck、renca)、胚胎干细胞系(例如h1、h9、wibr2、wibr3、g-olig2、esf158、rw.4、r1、d3)及其分化的细胞、或诱导多能干细胞系及其分化的细胞。

61.根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体、或根据权利要求50-53中任一项所述的重组宿主细胞在将外源核酸片段引入宿主细胞基因组中的用途。

62.根据权利要求61所述的用途，其中所述宿主细胞包括动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞。

63.根据权利要求62所述的用途，其中所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

64.根据权利要求63所述的用途，其中所述宿主细胞包括原代细胞(例如间充质干细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、免疫细胞)、永生化细胞系(例如hek293、nih-3t3、raw-264.7、sto、vero、ct26、htert永生化的人内皮/上皮/成纤维/角质/导管/细胞系)、癌细胞系(例如hela、hepg2/3、hl-60、ht-1080、ht-29、a549、sw620、hct-15、hct116、mda-mb-231、mcf7、sk-ov-3、panc-1、aspc-1、thp-1、huh7、kg-1、raji、hb-cb、jurkat、k562、crl5826、cho、mdck、renca)、胚胎干细胞系(例如h1、h9、wibr2、wibr3、g-olig2、esf158、rw.4、r1、d3)及其分化的细胞、或诱导多能干细胞系及其分化的细胞。

65.根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体、或根据权利要求50-53中任一项所述的重组宿主细胞在制备基因疗法、细胞疗法、基因组研究、或干细胞诱导和诱导后分化的药物或制剂中的用途。

66.一种试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶、编码根据权利要求1-12中任一项所述的转座酶的核酸、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14-16中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求17-21中任一项所述的核酸组、根据权利要求22-30中任一项所述的核酸组构建体、根据权利要求32-45中任一项所述的组合物、根据权利要求46-49中任一项所述的重组载体、或根据权利要求50-53中任一项所述的重组宿主细胞。