一种鉴别金银花饮片品种的引物组合和鉴别方法

本发明涉及药用生物，特别是涉及一种鉴别金银花饮片品种的引物组合和鉴别方法。

背景技术：

1、目前，国内外学者主要从基原水平上进行物种鉴定，在基原水平下金银花饮片品种鉴定相关研究较少，在金银花混合饮片品种鉴定方法鉴定方面也少有研究。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴别金银花饮片品种的引物组合和鉴别方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种鉴别金银花饮片品种的引物组合，包括marker1～15引物对；

4、所述marker1引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、所述marker2引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

6、所述marker3引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；

7、所述marker4引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；

8、所述marker5引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；

9、所述marker6引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；

10、所述marker7引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；

11、所述marker8引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；

12、所述marker9引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.17所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.18所示；

13、所述marker10引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.20所示；

14、所述marker11引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.21所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.22所示；

15、所述marker12引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.23所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.24所示；

16、所述marker13引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.25所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.26所示；

17、所述marker14引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.27所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.28所示；

18、所述marker15引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.29所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.30所示。

19、本发明提供了一种鉴别金银花饮片品种的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组合。

20、本发明还提供了一种鉴别金银花饮片品种的方法，包括以下步骤：

21、1)提取金银花饮片的基因组dna，以所述基因组dna为模板经权利要求1所示的引物组合进行pooling测序，再进行数据质控，计算目标位点的基因型和检出率；

22、2)根据所述步骤1)得到的目标位点的基因型和检出率确定所述金银花饮片的品种。

23、优选的，所述pooling测序包括两轮pcr扩增，第一轮pcr扩增的体系为：浓度为10ng/μl的基因组2μl、浓度为10μm的上游引物1μl、浓度为10μm的下游引物1μl和2×pcrreadymix15μl；

24、第二轮pcr扩增的体系为：浓度为10ng/μl的第一轮扩增产物2μl、浓度为10μm的通用p7引物1μl、浓度为10μm的通用p5引物1μl和2×pcrreadymix15μl。

25、优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：98℃3min；98℃30s，50℃30s，72℃30s，8个循环；98℃30s，66℃30s，72℃30s，25个循环；72℃5min；

26、所述第二轮pcr扩增的程序为：98℃5min；94℃30s，55℃20s，72℃30s，5个循环；72℃5min。

27、优选的，将各个引物对扩增得到的pcr产物混合后使用hiseqxten测序仪进行测序。

28、优选的，所述步骤1)数据质控包括：

29、a使用cutadapt(v 1.2.1)软件切除任何含有测序接头序列的部分序列；

30、b使用prinseq-lite(v0.20.3)软件对剩下的序列进行质控，依照序列的3'端往5'端的顺序，删除质量阈值低于20的碱基，剩下的序列视作质控合格的序列；

31、c接着使用bwa(v0.7.13-r1126)软件将质控合格的序列比对到参考基因组上，参数为默认参数，根据比对结果，通过samtools软件(版本0.1.18)计算目标位点的基因型结果，最后annovar(2018-04-16)软件用于对突变位点进行基因注释。

32、优选的，所述步骤1)根据目标位点的基因型和检出率确定所述金银花饮片的品种包括：

33、a在得到位点8和位点15这两个位点都为纯合位点c/c和g/g时，通过在忍冬snp指纹图谱比较后发现，通过筛选出同时包含该两个位点的品种发现，相同的品种为‘封花1号’、‘鲁峰王’、‘巨花1号’、‘巨花2号’、‘密县大毛花’和‘封金1号’；

34、b在得到位点8和位点15这两个位点都为纯合位点t/t和g/g时，只存在一个品种‘豫金3号’；

35、c在得到位点8和位点15这两个位点都为纯合位点c/c和t/t时，查看位点9，若位点9的基因型为g/g时，则品种为‘龙花’，若位点9的为a/a时，再查看位点14有无检出，未检出品种为‘豫金2号’，检出则品种为‘淡红金银花’；

36、d在得到位点8和位点15这两个位点为t/c和t/g时，且检出率在都在50％时，当位点1为杂合时，品种为‘丰蕾’，当位点12为杂合时，品种为‘密县野生’，位点14未检出时查看位点9，若位点9为杂合且位点7为杂合时，品种为‘小鸡爪’，纯和品种为‘华金6号’，若位点9为纯和且位点7为g/g或a/g则品种为‘特蕾1号’，位点7为a/a则品种为‘百农2号’；

37、e在得到位点8为t/c和位点15为t/t或g/g时，且保证位点8检出率为50％且位点15检出率为100％，查看位点14，若未检出且位点7为纯和则品种为‘白云’，位点3纯和则品种为‘银翠蕾’，两个位点都为纯和则品种为‘懒汉王’，若位点14检出，查看位点12，位点12为g/g且位点13为t/t则品种为‘华金3号’，位点13为c/c则品种为‘大鸡爪’，若位点12为杂合时，查看位点5，位点5为g/g则品种为‘九丰1号’，a/a则品种为‘长针线花’；

38、f在得到位点8为t/t或c/c和位点15为t/g时，且保证位点8检出率在100％且位点15检出率为50％，查看位点14，若未检出品种为‘龙瑶’，检出则查看位点12，为g/g则品种为‘粉红佳人’、‘魏紫’和‘明黄’，若位点12为杂合则品种为‘豫金4号’。

39、优选的，所述marker1～15引物对依次扩增位点1～15。

40、本发明的有益效果：

41、本发明利用现有技术能够通过对基原水平下金银花单一品种饮片和混合品种饮片进行物种鉴定，并能够准确判断混合品种的比例，达到定性和定量的目的，直接测序法方便快捷。

42、本发明拓宽了snp分子标记技术在中药饮片品种鉴定中的应用，为snp分子标记在其他物种的品种鉴定应用奠定基础，为忍冬snp指纹图谱在中成药检测研究提供理论方法，为中药材种源追溯系统的建立奠定基础，为建立中药材饮片品种鉴定标准提供理论支撑。