贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、贝莱斯芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，大部分芽孢杆菌具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、抗逆性强和生物安全性高等优点，从而作为益生菌在农业、食品、工业、医学、冶金、林业、环保以及军事等方面被广泛研究近年来，关于贝莱斯芽孢杆菌的研究主要集中在饲料、医药、纺织、水产、污水处理、植物保护等领域。作为一种新型生防微生物因子，贝莱斯芽孢杆菌在植物病害防控、促进植物生长等方面备受关注。

2、双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物，具有抗肿瘤、增强免疫、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。但双歧杆菌严格厌氧，且高温稳定性差，在工业化生产上，存在较多的技术难点，目前主要依靠低温冷冻干燥，工艺繁琐，成本高。

3、此外，毕赤酵母是生产有用异源蛋白的重要宿主，异源蛋白主要分泌于发酵上清液，发酵结束后得到的高密度毕赤酵母是一种具有高能量密度化特征的废弃生物质，含有约40％的蛋白质(氮源)和30％的多糖(碳源)，但是其变废为宝，实现再利用的情况较为少见。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术中双歧杆菌工艺应用受限，毕赤酵母资源浪费等问题。

2、为此，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂制备方法，包括以下步骤：

3、(1)将贝莱斯芽孢杆菌和双歧杆菌接种至发酵培养基中发酵；

4、(2)发酵结束后，所述发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

5、具体的，步骤(1)中以发酵培养基质量计，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为0.1-20％，所述双歧杆菌的接种量为0.5-30％。

6、具体的，以质量百分比计，所述发酵培养基包括糖蜜0.5-2.5％，麦芽糊精0.5-4％，葡萄糖0-3％，酵母提取物10％，豆粕0-3％，麸皮0-3％，玉米浆0-3％，磷酸氢二钾0.01-1.5％，磷酸氢二铵0.01-1.5％，乙酸钠0.01-1.5％，七水硫酸镁0.01-1.5％，四水氯化锰0.01-1.5％，碳酸钙0.01-1.5％，余量为水。

7、具体的，以质量百分比计，所述发酵培养基包括糖蜜0.5-2.5％，蔗糖0.5-4％，酵母提取物30％，发酵豆粕0-3％，玉米淀粉0-3％，玉米浆0-3％，磷酸氢二钾0.01-1.5％，柠檬酸铵0.01-1.5％，磷酸氢二铵0.01-1.5％，乙酸钠0.01-1.5％，硫酸亚铁0.01-1.5％，七水硫酸镁0.01-1.5％，四水氯化锰0.01-1.5％，碳酸钙0.01-1.5％，余量为水。

8、具体的，上述酵母提取物采用以下步骤制备：向废弃毕赤酵母菌泥中加入乙酸乙酯和氢氧化钠，然后加入蛋白酶进行酶解，得到所述酵母提取物。

9、具体的，上述酶解具体为：以(1-5)：10的料水比向废弃酵母菌泥中加水，得到废弃酵母菌泥液。以废弃毕赤酵母菌泥液质量计，加入碱性蛋白酶3‰-5‰，于50-55℃酶解12-16h后，再调ph至5.5-7.5，加入1‰-4‰风味蛋白酶，酶解6-12h后灭酶。

10、具体的，上述步骤(2)还包括将发酵液离心浓缩，向其中加入干燥保护剂，干燥后得到固态贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

11、具体的，上述步骤(2)还包括调节发酵液ph至4.8-5.2，向其中加入稳定剂，混合均匀后加入甘油，得到液态贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

12、采用本发明提供的方法制备的贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂可用于耐高温饲料添加剂，还可用于制备提升动物肠道防御功能的饲料添加剂。

13、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

14、本发明提供的这种贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂通过将双歧杆菌与贝莱斯芽孢杆菌的混合发酵，一方面利用贝莱斯芽孢杆菌分泌出的谷氨酸，小肽等小分子物质为自身生长繁殖提供营养，另一方面贝莱斯芽孢杆菌为好氧型细菌，在生长过程中不断消耗反应器中的氧气，并在培养基表面形成一层致密的菌膜，隔绝空气与培养基，使培养基内逐步形成厌氧环境，而双歧杆菌为厌氧型细菌，此举有利于双歧杆菌的生长繁殖。而且贝莱斯芽孢杆菌形成的γ-聚谷氨酸等大分子，可以为双歧杆菌提供保护，使其在后处理阶段，减少因干燥高温以及与氧气接触所带来的损伤。此外，贝莱斯芽孢杆菌在生长过程能够产生蛋白酶及淀粉酶等次级代谢产物，对麸皮豆粕等原料进行分解，使得发酵液中游离的氨基氮及其他小肽、氨基酸含量增加，便于延滞期较贝莱斯芽孢杆菌久的双歧杆菌可以直接利用，进行菌体的生长繁殖。

15、本发明通过对毕赤酵母菌泥进行酶解后，直接作为发酵原料进行发酵，一方面解决酵母菌泥造成的环境问题，另一方面为微生物发酵提供营养丰富的原料(酶解后酶解液氨基态氮含量达0.4％-8％，还原性糖含量为0.5％-1.6％，还富含核苷酸等其他营养物质)，节省生产成本。

16、本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂可用作饲料添加剂，加入至饲料预制过程中，能明显提高双歧杆菌的喷雾干燥收率，实现由冷冻干燥转变为喷雾干燥，降低饲料成本。此外，混合菌剂还可进行水体养殖泼洒，提升动物肠道的防御功能。

17、以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

1.一种贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中以发酵培养基质量计，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为0.1-20％，所述双歧杆菌的接种量为0.5-30％。

3.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于：以质量百分比计，所述发酵培养基包括糖蜜0.5-2.5％，麦芽糊精0.5-4％，葡萄糖0-3％，酵母提取物10％，豆粕0-3％，麸皮0-3％，玉米浆0-3％，磷酸氢二钾0.01-1.5％，磷酸氢二铵0.01-1.5％，乙酸钠0.01-1.5％，七水硫酸镁0.01-1.5％，四水氯化锰0.01-1.5％，碳酸钙0.01-1.5％，余量为水。

4.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于：以质量百分比计，所述发酵培养基包括糖蜜0.5-2.5％，蔗糖0.5-4％，酵母提取物30％，发酵豆粕0-3％，玉米淀粉0-3％，玉米浆0-3％，磷酸氢二钾0.01-1.5％，柠檬酸铵0.01-1.5％，磷酸氢二铵0.01-1.5％，乙酸钠0.01-1.5％，硫酸亚铁0.01-1.5％，七水硫酸镁0.01-1.5％，四水氯化锰0.01-1.5％，碳酸钙0.01-1.5％，余量为水。

5.如权利要求3或4任意一项所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述酵母提取物采用以下步骤制备：向废弃毕赤酵母菌泥中加入乙酸乙酯和氢氧化钠，然后加入蛋白酶进行酶解，得到所述酵母提取物。

6.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)还包括将发酵液离心浓缩，向其中加入干燥保护剂，干燥后得到固态贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

7.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)还包括调节发酵液ph至4.8-5.2，向其中加入稳定剂，混合均匀后加入甘油，得到液态贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

8.一种贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂，其特征在于：所述混合菌剂采用权利要求1-7任意一项所述方法制备。

9.一种耐高温饲料添加剂，其特征在于：包括权利要求8所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂。

10.如权利要求8所述贝莱斯芽孢杆菌与双歧杆菌混合菌剂在制备提升动物肠道防御功能的饲料添加剂中的应用。