一种催化生成辛酰基丙氨酸的酶及其固定化方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及催化生成辛酰基丙氨酸的酶及其固定化方法和应用。

背景技术：

1、辛酰基丙氨酸（n-(1-oxooctyl)alanine），一种氨基酸表面活性剂，其结构式为：

2、

3、氨基酸表面活性剂是一类重要的天然表面活性分子。它们是由一个氨基酸作为酰基受体，和一个或多个非极性分子如长链脂肪酸作为酰基供体缩合而成的具有高表面活性的两亲分子。这种特性加上它们的毒性低，生物降解性好、生态相容性高，抗菌以及抗蚀、抗疾病等性能，使它们成为食品、制药和化妆品行业的首选分子。

4、有机试剂中反应得到脂肪酰基氨基酸盐，然后经无机酸中和分离的脂肪酰基氨基酸粗品，再加碱中和而成为较纯的脂肪酰基氨基酸盐。此化学方法合成存在难度大、产率低、合成过程不绿色，其反应副产物和环境污染问题难以解决。

5、如今越来越多的行业尝试发展可持续技术以减少废物的产生，减少环境问题和后处理成本。实现这些目标的最有效的方法之一是生物转化。酶法合成主要是通过生物酶催化脂肪酸及其衍生物和氨基酸进行酰胺化反应，因其绿色性、安全性受到广泛地研究关注。酶催化路径面临的主要挑战是已知的各类酶在催化酰化反应时活性不高，稳定性差，酶成本高，产品收率较低，这是目前制约酶法合成氨基酸表面活性剂的主要因素。

6、酰化酶（acylase，ec 3.5.1.4）催化氨基的酰化反应，是一种用于酰胺水解逆反应的酶，可催化正辛酸的羧基和丙氨酸的氨基脱去一分子水，生成辛酰基丙氨酸。天然存在的酰化酶底物谱窄，催化活性低，稳定性差，野生型植物源酰化酶（ vigna umbellata，xp_047162094）对辛酰基丙氨酸活性较高，但稳定性和利用率仍不足于工业应用。

7、在生物技术过程中成功使用酶的最有效的策略之一是它们的固定化。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特征的同时，又克服了游离酶的不足，具有贮存稳定性高，分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控和工艺简便等一系列优点。传统的酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法，几种方法各有优缺点，其中共价结合法制备成结合牢固的固定化酶比其他方法而言具有很大优势。

8、环氧类树脂是一种表面含有环氧基的合成树脂，该类载体在较长的周期内具有很强的耐微生物和酸碱腐蚀作用及较强的机械性能，非常适合作为工业化酶制剂的载体。表面的环氧基与酶分子表面的-nh2、-hs等非活性基团可以在很温和的条件下开环共价结合，从而将酶分子固定在载体表面。环氧基的反应条件温和，结合后酶分子一般不会被破坏，经过适当处理后可以得到稳定性良好的固定化酶。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种固定 vigna umbellata来源的酰化酶（简称vugh）的方法，并利用该固定化酶进行转化生产辛酰基丙氨酸。上述所得到固定化酰化酶，用于在底物溶液存在条件下，转化生产辛酰基丙氨酸。

2、利用酶固定化技术固定化酰化酶，提高酶对生产过程中的机械剪切力耐受性、对温度变化耐受性及对底物正辛酸的耐受性，最终增强酰化酶的稳定性，提高生物酶催化剂循环利用，简化后处理工艺，提高收率。因此需寻找不同固定化载体对酰化酶进行固定化，找出固定化酰化酶的最佳载体，在不影响其催化活性前提下，达到固定化酶最大套用次数。

3、本发明为实现上述目的采用以下技术方案：

4、本发明提供一种催化生成辛酰基丙氨酸的酶的固定化方法，其包括如下步骤：

5、s1 向催化生成辛酰基丙氨酸的酶溶液中加环氧基树脂载体，20-30℃震荡混合12-24h；

6、s2 其后进行过滤收集固定化酶，用磷酸钾缓冲液淋洗过滤，得到固定化酶。

7、优选地，所述催化生成辛酰基丙氨酸的酶是来自 vigna umbellata来源的酰化酶；或者在其c端添加1-50个赖氨酸得到的酶。更优选地，所述赖氨酸的数量为5-30个。

8、进一步优选地，所述环氧基树脂载体使用前进行活化，将所述环氧基树脂载体于ph7.0-8.5缓冲液置于18-25℃振摇0.5至2h，抽滤后用去离子水洗涤载体至水清。

9、具体地，所述环氧基树脂载体的型号为ep109，环氧基树脂载体的用量是游离酶质量50-150%。

10、在具体实施方式中，所述催化生成辛酰基丙氨酸的酶通过重组菌表达纯化得到。

11、本发明提供所述的固定化方法得到固定化的催化生成辛酰基丙氨酸的酶。

12、本发时进一步提供所述的酶在制备辛酰基丙氨酸中的用途。

13、本发明也提供一种制备辛酰基丙氨酸的方法，其包括如下步骤：将所述的酶加入含有正辛酸的底物溶液中震荡反应。

14、优选地，所述底物溶液是含正辛酸的饱和丙氨酸溶液，ph7.5至8.5；所述正辛酸浓度10-100g/l；震荡反应是于45-65℃于反应12-24小时。

15、更优选地，反应完成后分离固定化酶和反应液，回收固定化酶，用于下个批次的反应，重复使用1至20次。

16、本发明有益效果如下：本发明将酰化酶与ep109共价固定，可以有效提高固定化酶的稳定性，尤其是热稳定性、耐受底物正辛酸的稳定性，可以重复套用20次，工艺简单，成本低廉，产率高，具有工业化生产的应用价值。

1.一种催化生成辛酰基丙氨酸的酶的固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述催化生成辛酰基丙氨酸的酶是来自vigna umbellata来源的酰化酶；或者在其c端添加1-50个赖氨酸得到的酶。

3.如权利要求2所述的固定化方法，其特征在于，所述赖氨酸的数量为5-30个。

4.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述环氧基树脂载体使用前进行活化，将所述环氧基树脂载体于ph7.0-8.5缓冲液置于18-25℃振摇0.5至2h，抽滤后用去离子水洗涤载体至水清。

5.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述环氧基树脂载体的型号为ep109，环氧基树脂载体的用量是游离酶质量50-150%。

6.如权利要求1至5任一项所述的固定化方法，其特征在于，所述催化生成辛酰基丙氨酸的酶通过重组菌表达纯化得到。

7.如权利要求1至6任一项所述的固定化方法得到固定化的催化生成辛酰基丙氨酸的酶。

8.如权利要求7所述的酶在制备辛酰基丙氨酸中的用途。

9.一种制备辛酰基丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将如权利要求7所述的酶加入含有正辛酸的底物溶液中震荡反应。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述底物溶液是含正辛酸的饱和丙氨酸溶液，ph7.5至8.5；所述正辛酸浓度10-100g/l；震荡反应是于45-65℃于反应12-24小时。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，反应完成后分离固定化酶和反应液，回收固定化酶，用于下个批次的反应，重复使用1至20次。