ApoE的核酸调节的制作方法

本发明涉及生物技术、医学和基因疗法领域。本发明涉及包含两个或更多个rna编码序列的核酸，其中一个rna编码序列含有与apoe基因的一部分基本上互补的指导序列)；相关的组合物、药物组合物及其在治疗中的用途。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种进行性神经系统变性障碍，其被认为是成年人痴呆的主要原因(van cauwenberghe等人2016,genet med.[医学遗传学]；18:421:30)。该疾病的特征在于细胞外淀粉样蛋白-β(aβ)斑块和细胞内神经原纤维缠结的积累，其引起神经元细胞死亡和神经胶质细胞激活，最终导致脑功能降低。淀粉样蛋白斑块的形成是由于β-分泌酶和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白(app)的切割。神经原纤维缠结的形成反而是由于τ蛋白的错误折叠(pospich和raunser 2017,science[科学]；358:45-46)。

2、增加发生ad的风险的遗传因素之一与人载脂蛋白(apoe)基因有关。人apoe基因具有单核苷酸多态性(snp)，其产生以下三种主要等位基因变体：ε2、ε3和ε4(即，apoe亚型e2、e3和e4)(belbin等人2007,hum mol genet.[人类分子遗传学]；16:2199-208)。ε4变体参与迟发性ad(load)，并且apoeε4的携带者以等位基因数量依赖性方式增加ad发作的风险，即一个apoeε4等位基因使发作年龄平均提前2-5岁，而两个apoeε4等位基因的存在使发作提前5-10年。重要的是，40％-65％的ad患者携带至少一个apoeε4等位基因。此外，还已经观察到apoe4与动脉粥样硬化、颅脑损伤(tbi)和其他疾病中的不利结果相关。相比之下，apoeε2和/或apoeε3等位基因对ad发生发挥保护性或中性作用(yamazaki等人2016,cnsdrugs[cns药物].；30:773-89)。

3、由apoe基因编码的apoe蛋白是一种分泌型脂质转运蛋白，其发现于外周和中枢身体系统(如中枢神经系统(cns))中。在外周中，apoe主要由肝细胞分泌，而在cns中，星形胶质细胞是apoe的主要来源(chernick等人2019,neurosci lett.[神经科学快报]；708:134306)。

4、apoe基因中的snp诱导位于位置130和176(当不包括蛋白质的信号肽时，也分别称为位置112和158)处的氨基酸残基处的差异(apoeε2，cys112/cys158；apoeε3，cys112/arg158；apoeε4，arg112/arg158)。这些单氨基酸多态性被认为严重影响apoe的结构和功能，从而影响aβ代谢、聚集、沉积和τ蛋白磷酸化。(liu等人2013,nat rev neurol.[自然评论神经学]；9:106-18)。

5、考虑到ad的复杂病理生理学和相关的基因调节网络，目前没有用于治疗ad的有希望的疗法，因此迫切需要找到这样的疗法。

技术实现思路

1、本发明通过应用核酸技术解决了该问题，其中所述核酸包含两个或更多个rna编码序列，其中一个rna编码序列含有与apoe基因的一部分基本上互补的指导序列，并且另一个rna编码序列可能通过簇形成支持第一rna编码序列的表达。因此，增加apoe基因的沉默。

2、在一方面，提供了一种表达盒，该表达盒包含根据本发明的核酸，其中该表达盒是dna分子。

3、在一方面，提供了一种腺相关病毒(aav)载体，该腺相关病毒载体包含根据本发明的表达盒。

4、在一方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、或根据本发明的aav载体以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

5、在一方面，提供了根据本发明的核酸、或根据本发明的表达盒、或根据本发明的aav载体、或根据本发明的药物组合物，用于作为药剂使用。

6、在一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的核酸、或根据本发明的表达盒、或根据本发明的aav载体、或根据本发明的药物组合物，其中该试剂盒进一步包含免疫抑制剂。

7、在一方面，提供了一种表达盒，该表达盒包含编码选自seq id no.249-254的一种或多种apoe2和apoe3蛋白的核酸，用于在基因疗法中使用。

1.一种核酸，该核酸包含编码第一rna的序列和编码第二rna的序列，其中该第二rna包含与apoe基因的一部分基本上互补的至少19个核苷酸的指导序列，并且其中该第一rna和该第二rna各自包含发夹。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中，在5'至3'方向上，编码该第一rna的该序列之后是间隔子，该间隔子之后是编码该第二rna的该序列，并且其中该间隔子是至少50个核苷酸。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸，其中该第二rna中的该发夹包含至少40个核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中该第一rna包含seq id no.235或其变体，并且该第二rna包含seq id no.190或其变体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸，其中该指导序列是至少22个核苷酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸，其中该指导序列对apoe4基因的一部分具有特异性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸，其中该指导序列与选自seq id no.16、24、54的序列基本上互补。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸，其中该第一rna发生突变以减少该第一rna的加工和/或表达。

9.一种表达盒，该表达盒包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中该表达盒是dna分子。

10.根据权利要求9所述的表达盒，该表达盒进一步包含编码apoe2和apoe3中的至少一种的第二核酸，其中该第一核酸和该第二核酸可操作地连接至启动子并且任选地连接至聚a信号，其中优选地，该第二核酸编码包含seq id no 249-254之一的蛋白质和/或该第二核酸包含seq id no.195-217之一。

11.根据权利要求10所述的表达盒，其中该第二核酸不包含与如权利要求1至7中任一项所定义的指导序列基本上互补的序列，其中优选地，该核苷酸序列经密码子优化以在人细胞中表达。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的表达盒，其中该第二核酸包含选自seq idno.195-217的序列。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的表达盒，其中编码该第一rna的该序列和编码该第二rna的该序列包含在内含子序列中。

14.根据权利要求13所述的表达盒，其中内含子序列存在于该启动子中，其中优选地该内含子序列包含seq id no.231。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的表达盒，其中该启动子是能够驱动在脑细胞中转录的启动子，其中优选地，该启动子包含seq id no.191、192、193或232之一。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的表达盒，其中该表达盒侧接反向末端重复(itr)。

17.一种腺相关病毒(aav)载体，该腺相关病毒载体包含根据权利要求16所述的表达盒。

18.根据权利要求17所述的aav载体，该aav载体包含aav5或aav9衣壳蛋白。

19.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

20.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体、或根据权利要求19所述的药物组合物，用于作为药剂使用。

21.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体、或根据权利要求19所述的药物组合物，用于在治疗和/或预防受试者的阿尔茨海默病中使用。

22.根据权利要求20所述的用于该用途的根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体、或根据权利要求19所述的药物组合物，其中该受试者是apoe4等位基因的携带者，其中优选地该受试者是apoe4等位基因纯合的。

23.根据权利要求20或21所述的用于该用途的根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体、或根据权利要求19所述的药物组合物，其中将该核酸、该表达盒、该aav载体或该药物组合物优选地通过脑内注射、实质内注射、鞘内注射或其组合，更优选地通过对流增强递送施用至中枢神经系统。

24.一种试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、或根据权利要求9至16所述的表达盒、或根据权利要求17或权利要求18所述的aav载体、或根据权利要求19所述的药物组合物，其中该试剂盒进一步包含免疫抑制剂。

25.一种表达盒，该表达盒包含编码选自seq id no.249-254的一种或多种apoe2和apoe3蛋白的核酸，用于在基因疗法中使用。

26.根据权利要求25所述的表达盒，其中所述一种或多种蛋白质由包含至少部分野生型序列的核酸序列编码。

27.根据权利要求25所述的表达盒，其中所述一种或多种蛋白质由包含全长野生型编码序列的核酸序列编码。

28.根据权利要求25所述的用于该用途的表达盒，其中该表达盒包含选自seq idno.195-201的一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列任选地可操作地连接至启动子和聚a信号。

29.根据权利要求25至28所述的表达盒，其中该表达盒侧接itr。

30.一种腺相关病毒(aav)载体，该腺相关病毒载体包含根据权利要求25至29中任一项所述的表达盒。

31.根据权利要求30所述的aav载体，该aav载体包含aav5或aav9衣壳蛋白。

32.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求30或权利要求31所述的aav载体以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

33.根据权利要求25至29所述的表达盒、或根据权利要求30或权利要求31所述的aav载体、或根据权利要求32所述的药物组合物，用于在治疗和/或预防受试者的阿尔茨海默病中使用。

34.根据权利要求33所述的用于该用途的根据权利要求25至29所述的表达盒、或根据权利要求30或权利要求31所述的aav载体、或根据权利要求32所述的药物组合物，其中该受试者是apoe4等位基因的携带者，其中优选地该受试者是apoe4等位基因纯合的。

35.根据权利要求33所述的用于该用途的根据权利要求25至29所述的表达盒、或根据权利要求30或权利要求31所述的aav载体、或根据权利要求32所述的药物组合物，其中将该表达盒、该aav载体或该药物组合物优选地通过脑内注射、实质内注射、鞘内注射或其组合，更优选地通过对流增强递送施用至中枢神经系统。

36.一种试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求25至29所述的表达盒、或根据权利要求30或权利要求31所述的aav载体、或根据权利要求3所述的药物组合物，其中该试剂盒进一步包含免疫抑制剂。