一种用于等温条件下鉴别诊断羊尤氏泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于等温条件下鉴别诊断羊尤氏泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法。

背景技术：

1、羊泰勒虫病是一种蜱传性血液原虫病，目前公认感染羊的泰勒虫有6种，分别是尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、莱氏泰勒虫、分离泰勒虫、隐藏泰勒虫。我国报道的羊泰勒虫主要有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫。羊感染泰勒虫后，精神状态会越来越差，情绪不稳定，出现抑郁倾向，食欲差或不进食，高烧，心律不齐、贫血、淋巴结肿大等症状。且各泰勒虫之间的症状并无显著的差异，因此，无法仅仅通过临床症状判断感染的类型。

2、目前，羊泰勒虫病实验室诊断的方法主要有病原形态观察、血清学检测及pcr检测。血涂片或淋巴结涂片染色法是最传统的实验室诊断方法，该方法简便、廉价，但是依赖于检测人员的寄生虫形态学经验，当染虫率较低或隐性感染时存在漏检，该方法的准确性有待验证，且上述方法忽略了载体动物，干扰信号从成像焦平面以外进入而使画面分辨率降低，而且由于不同种泰勒虫在形态上具有相似性而难以区别。

3、随着检测技术的不断更新，羊泰勒虫病的检测方法也有了迅速的发展。间接免疫荧光试验(ifa)、酶联免疫吸附试验(elisa)、胶体金免疫层析试纸条(ics)等血清学检测方法已用于羊泰勒虫病的检测。尤其elisa是我国应用最主要、最广泛的血清学检测方法，虽然血清学检测方法具有易于操作、可大量检测样品等优点，但是不能将尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫进行区分，且与其他梨形虫存在交叉反应的问题。例如发明专利cn104730239a公开了羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，所述的试纸条包括pvc垫，pvc垫上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫、包被有金标记的尤氏泰勒虫tuip重组蛋白抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方；硝酸纤维素膜上分别包被有尤氏泰勒虫tuip重组蛋白抗原的检测线和多克隆抗体的质控线，还提上述检测试纸条的制备方法。发明专利cn101597650a公开了检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜及方法，所述的方法是将待检血蜱体内提取的dna作为模板，以特定的引物进行pcr扩增，其产物与检测的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜上放x光胶片进行曝光、显影等处理，根据胶片上产生的强度信号确定被检动物是否有患有相应的疾病。

4、本发明根据尤氏泰勒虫核糖体大亚基rna基因序列设计了几组特异性lamp引物，并筛选得到了一组效果最好的lamp引物，建立一种检测尤氏泰勒虫的lamp-lfb方法，该lamp-lfb检测方法特异性高、灵敏性高，能准确、快速的检测尤氏泰勒虫。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种用于检测尤氏泰勒虫的靶序列，所述的靶序列的核苷酸序列如seq id no.29所示。

2、本发明的第二目的是提供一种用于检测尤氏泰勒虫lamp引物组，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seq id no.27所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.28所示.

3、本发明的第三目的是提供一种用于检测尤氏泰勒虫的的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。

4、优选的，所述试剂盒建立了lamp反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为59～66℃，反应时间设置20～70min。

5、优选的，所述的lamp反应体系：内外引物浓度比例为8:1，mgso4的浓度为6mmol/l，dntpmix的浓度为1.4mmol/l，反应温度设置为65℃，反应时间设置40min。

6、本发明的第四目的是提供利用所述的试剂盒在非诊断目的的检测尤氏泰勒虫中的应用。

7、本发明的第五目的是提供一种尤氏泰勒虫的lamp可视化检测方法，包括以下步骤：

8、(1)提取待测样品的dna；

9、(2)将步骤(1)提取得到的dna，加入权利要求3-5任一项所述试剂盒中，进行反应；

10、(3)对反应结果进行判定：当dna扩增产物中存在如seq id no.29所示如靶序列时，t线、c线均显色，判定为阳性；只有c线显色，标记为阴性；t线、c线均不显色，判定为无效。

11、本发明的第六目的是提供一种利用所述的lamp引物组在非诊断目的的检测尤氏泰勒虫中的应用。

12、本发明的有益效果是：本发明提供了用于检测尤氏泰勒虫的靶序列和对应的lamp引物组，并筛选建立了lamp体系，使用所述的lamp引物组和lamp体系制备了用于检测尤氏泰勒虫的的试剂盒，所述的试剂盒在检测尤氏泰勒虫时，具有特异性高、敏感性高以及临床可行性强的特点，且操作简单，不需要复杂的仪器，检测成本低。

1.一种用于检测尤氏泰勒虫的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如seqid no.29所示。

2.一种用于检测尤氏泰勒虫lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seqid no.27所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.28所示。

3.一种用于检测尤氏泰勒虫的的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒建立了lamp反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为59～66℃，反应时间设置20～70min。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的lamp反应体系：内外引物浓度比例为8:1，mgso4的浓度为6mmol/l，dntp mix的浓度为1.4mmol/l，反应温度设置为65℃，反应时间设置40min。

6.利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测尤氏泰勒虫中的应用。

7.一种尤氏泰勒虫的lamp可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种利用权利要求2所述的lamp引物组在非诊断目的的检测尤氏泰勒虫中的应用。