gag重组表位蛋白及其应用

本发明属于病毒检测，具体涉及gag重组表位蛋白及其应用。

背景技术：

1、绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis，opa；sheep pulmonaryadenomatosis，spa)是由绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，jsrv)引起的一种慢性、进行性、接触性传染的肺脏肿瘤性疾病，以肺泡和支气管上皮呈现出进行性腺瘤样增生、咳嗽、流鼻涕、消瘦、呼吸困难为主要特征，并最终导致死亡。

2、流行病学调查结果显示opa发病多以典型和非典型混合特征出现，临床诊断难以被发现，多在羊死亡或屠宰后通过opa组织病理学检测方法发现相应的肺组织病理变化而确诊。特别是感染opa的羊体内不能检出针对jsrv的循环抗体或t淋巴细胞应答，因此，opa患羊的早期诊断仅能够通过实验室的jsrv核酸pcr(polymerase chain reaction)检测。

3、然而，opa组织病理学检测的样品为病死羊的肺组织，样品采集不方便，来源少；而且只能在羊死亡或屠宰后进行，羊场群体的opa检测净化、引种检疫和opa流行病学调查，对临床安全生产无指导意义。pcr技术检测针对核酸，包括采样、rna抽提、反转录、基因扩增等环节，结果的影响因素多，且存在操作过程复杂、耗时长、成本高等不足。再者，opa组织病理学和pcr技术检测都存在一次能检测的样品数量少，不能进行临床大量样品的批量化诊断检测的缺陷；又如，opa组织病理学和pcr技术检测都是单样品操作，受操作人员技术水平和其他因素影响较大，结果稳定性不足。

4、因此，开发能够针对病原结构蛋白、可在临床进行大批量检测的试剂或方法，将能够有效解决opa诊断存在的问题，实现羊场opa净化，保障羊群健康，并促进养羊业的快速发展。

技术实现思路

1、为了改善jsrv检测试剂性能，本发明人对gag全长蛋白进行研究，通过大量实验，从多种不同的截短型蛋白中选取了一种特异性强、重复性好、敏感性高，且满足免疫诊断试剂开发需求的gag重组表位抗原，从而完成本发明。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种gag重组表位蛋白，所述gag重组表位蛋白的氨基酸序列：

4、1)如seq id no:1所示；或者

5、2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基酸获得的衍生的氨基酸序列，所述衍生的氨基酸序列具有1)中所示的氨基酸序列的活性。

6、第二方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸：

7、a)编码权利要求1所述的gag重组表位蛋白；

8、b)如seq id no:2所示；或者

9、c)与a)或b)互补。

10、第三方面，提供一种多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体含有如本发明所述的多核苷酸。

11、第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明所述的多核苷酸。

12、第五方面，提供用于检测jsrv的组合物，所述组合物包括如本发明所述的gag重组表位蛋白，所述gag重组表位蛋白包被在固相支持物上，或者所述gag重组表位蛋白带有可检测的标记物。

13、第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的gag重组表位蛋白。

14、优选的，

15、1)所述gag重组表位蛋白包被在固相支持物上；

16、2)所述gag重组表位蛋白带有可检测的标记物；或者

17、3)所述gag重组表位蛋白未包被在固相支持物上且未带有可检测的标记物。

18、第七方面，提供一种用于检测jsrv的试剂盒，所述试剂盒包括：

19、包被有gag重组表位蛋白的固相支持物，

20、抗gag重组表位蛋白的兔多克隆抗体，

21、带有可检测的标记物的抗兔单克隆抗体。

22、第八方面，提供本发明所述的gag重组表位蛋白在制备用于检测jsrv的组合物或用于检测jsrv的试剂盒中的应用。

23、第九方面，提供本发明所述的组合物或试剂盒在检测jsrv中的应用。

24、在本发明中，gag重组表位蛋白(抗原)的质量是影响jsrv免疫检测的最关键因素，故本领域中存在对gag重组表位蛋白(抗原)的性能不断改进以更好地提升、满足jsrv体外检测能力的需求。同时，由于病毒性传染病的抗原往往较大，在体外难以实现完整抗原蛋白的表达，或者即使实现体外表达，分子量比较大的抗原蛋白也往往不能正确折叠，导致后期的复性困难，或者复性获得的抗原活性很差，制约了检测试剂的开发。

25、为此，本发明提供了一种新的gag重组表位蛋白(抗原)，其选取了gag全长蛋白的304-605aa区域。这样的重组抗原不仅涵盖gag重组表位蛋白(抗原)的优势抗原表位区域，还具有优于与选取区域略有不同的其它抗原的检测能力，同时具有更强的特异性、更好的重复性以及更高的敏感性。

26、在本发明中，衍生的重组抗原可以与如seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的一致性。

27、氨基酸(或核酸)序列之间的一致性百分比可以使用本领域技术人员已知的标准方法来确定。例如，为了确定两条氨基酸序列之间的同源性百分比，将序列进行比对以达到最佳比较目的。然后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。可以在一条或两条氨基酸序列中引入空位以实现最佳比对，而且为了比较的目的可以忽略非同源序列。当第一序列中的位置被与第二序列相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基占据时，则在该位置处，这两条序列是一致的。考虑进为了最佳比对而引入的空位的数量和每个空位的长度，两条序列之间的一致性百分比是由这两条序列共有的相同位置的数量的函数。两条序列之间的序列比较和一致性百分比及相似性可以使用数学算法来确定。

28、本发明的试剂盒可采用本领域技术人员熟知的多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需试剂的测试盒、微流体芯片等，可以按照已知的标准步骤来制造试剂盒。例如，本发明的试剂盒可以是胶体金试纸。例如，本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。

29、在本发明中，本发明的gag重组表位蛋白(抗原)在用于制备试剂盒或组合物的情况下，例如可以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相支持物上[例如，膜(如nc膜)、板、珠(如磁珠)、微球(诸如羧基微球、氨基微球、氯甲基微球、物理吸附微球等)]，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

30、在本发明中，本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他反应物包括但不限于，除本发明的gag重组表位蛋白(抗原)外的其他gag抗原等。上述其他反应物可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相支持物上，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

31、在本发明中，本发明的试剂盒中用于进行检测所需的其他材料包括但不限于用于取样材料、用于进行对照材料和/或用于观察检测过程或结果的材料。

32、在本发明中，本发明的试剂盒中用于进行检测所需的其他试剂包括但不限于缓冲液、洗涤剂、显色剂和/或终止剂。

33、在本发明中，本发明的gag重组表位蛋白(抗原)在用于制备试剂盒或组合物的情况下经可检测地标记。可以使用本领域技术人员已知的任何标记物和标记方法。常用的标记物可包括酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如32p或125i)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。

34、在本发明中，用于进行检测所需的其他反应物中的一种或更多种也可以为可检测地标记的。

35、在本发明中，本发明包括一种检测受试对象中jsrv存在的方法。例如，检测方法包括：使受试对象的样本与包被有本发明的gag重组表位蛋白(抗原)的固相支持物接触，再加入特异性抗体，使受试对象的样本与gag重组表位蛋白(抗原)竞争性结合特异性抗体。然后加入带有可检测的标记物的二抗，使其与特异性抗体结合，形成带有可检测的标记物的二抗-特异性抗体-抗原复合物。随后通过测量可检测标记物获得检测结果。检测方法包括但不限于elisa(酶联免疫吸附测定)、放射自显影、比浊法、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。

36、优选的，在形成复合物之后还包括洗涤步骤以去除未结合的组分。

37、在本发明中，样本可选自活体绵羊、山羊的血清、胸腔和鼻腔分泌物。

38、本发明还涉及编码gag重组表位蛋白(抗原)的多核苷酸，以例如用于生产本发明的重组抗原的融合蛋白。编码本发明gag重组表位蛋白(抗原)的多核苷酸包括但不限于：gag重组表位蛋白(抗原)的编码序列本身；gag重组表位蛋白(抗原)的编码序列及额外的编码序列；gag重组表位蛋白(抗原)的编码序列(和任选的额外的编码序列)及非编码序列，例如可以另外包括但不必限于一种或多种调节性核酸序列，其可以是受调节的或可调节的启动子、增强子、其它转录调节序列、抑制子结合序列、翻译调节序列或任何其它调节性核酸序列。

39、本发明也包括等效的多核苷酸构建体。本领域技术人员能够理解，多核苷酸构建体用于通过重组表达制备重组抗原，该多核苷酸构建体包含可操作地连接到表达控制序列上的编码重组抗原的核酸分子，另外包含用于在各自宿主细胞中维持和繁殖的遗传元件，如复制起点和/或选择标记基因。

40、在本发明中，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同种抗体的群体的抗体，即，除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。针对单抗原位点，单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的，因为它们可以通过杂交瘤细胞株培养获得，并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。

41、在本发明中，术语“多单克隆抗体”是指含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，通过抗原免疫动物，动物产生抗体，获得含有抗体的动物血清，经初步纯化后获得的抗体，是为多克隆抗体。多克隆抗体主要存在于血清中，从免疫动物获得的血清即抗血清或称免疫血清。此类抗血清是针对抗原物质上多种抗原决定簇的多克隆抗体，而且是免疫球蛋白不同种类、亚类及型别的混合体。

42、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

43、本发明通过对gag全长蛋白的截取位置进行优化，从多种不同的截短型蛋白中筛选出gag重组表位蛋白，从而制备了特异性强、重复性好、敏感性高，且满足免疫诊断试剂开发需求的试剂盒。而且分别采用本发明试剂盒和pcr技术检测，结果显示，本发明试剂盒与pcr检测结果的符合率为98％，符合体外诊断试剂盒的使用要求。而且，本发明试剂盒检测程序为批量操作，能够适于临床批量化检测；还降低了操作人员间的操作误差，结果更准确客观。再者，本发明试剂盒操作步骤明确、规范，判定标准客观准确，适用于不同知识层次技术人员。

44、本发明抗gag重组表位蛋白的血清抗体效价为12800稀释度，有着较佳的免疫效果。

45、本发明gag重组表位蛋白可用于jsrv检测的elisa试剂盒，能够检测出opa的病原jsrv，不能够检测到羊布鲁菌病、羊快疫、羔羊痢疾、羊肠毒血症、羊猝狙、羊痘、小反刍兽疫、o型口蹄疫、羊支原体肺炎和羊地方性鼻内肿瘤病毒(entv)；具有很好的特异性结合能力；此外，本发明可用于jsrv检测的elisa试剂盒的重复性也很好，敏感性也很高。

46、一方面，本发明可检测的样本为活体绵羊、山羊的血清、胸腔和鼻腔分泌物，采样方便。

47、另一方面，本发明能够进行活体羊的任何时期jsrv的检测，可用于羊场群体的opa检测净化、引种检疫和opa流行病学调查。

48、可以理解，由于这些性质的存在，大大降低了jsrv的检测成本及使用限制。也就是说，本发明提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的gag重组表位蛋白。