一种FTO突变体及腺相关病毒及其在制备治疗骨质疏松药物中的应用

本发明属于医药，涉及一种fto突变体及腺相关病毒及其在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

背景技术：

1、炎症性肠病（inflammatory bowel diseases, ibd）是一种特发性慢性肠道炎症性疾病，主要包含溃疡性结肠炎（uc）和克罗恩病（cd），常见的症状有腹痛、腹泻等。ibd的肠源性炎症会对患者全身代谢产生影响。多数患者会并发骨量下降、骨质疏松，发生率分别可达67%和57.6%；相应地使骨折风险升高至正常人的1.3-1.4倍。现有研究主要聚焦于ibd中破骨细胞的过度激活导致的骨吸收增加，而现行ibd治疗指南仅强调维生素d、钙剂补充以及抗骨吸收药物应用等，但效果有限、安全性有待考量。骨量变化依赖于破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成相互偶联，以保持生理状态下的动态平衡。近年来，用于促骨形成的合成代谢疗法收获多方认可，尤其在骨量重度低下患者中疗效甚佳。然而，源于骨髓间充质细胞（bmsc）的成骨细胞所介导的骨形成在ibd中的变化却至今缺乏系统研究，制约着临床医生对ibd骨并发症的有效干预。

2、在2011年，何川教授发现了第一个m6a修饰去甲基化酶——fto（fat mass andobesity-associated protein）蛋白，fto蛋白位于细胞核内，其主要功能是通过氧化脱甲基酶活性降低m6a水平，fto针对单链rna中的m6a发挥去甲基化活性。体内fto酶活功能的失调会直接影响个体发育和疾病的发生，如肥胖症，癌症等。

3、有研究报道，fto通过调节m6a去甲基化水平和控制mrnas的稳定性在骨发育中发挥关键作用。fto通过hspa1a-nf-κb信号通路保护成骨细胞免受遗传毒性损伤，维持骨量；fto通过结合ppar-γ的mrna，加速bmscs的脂肪生成。fto的药理学抑制作用显著降低了bmd、骨矿物质含量（bmc）并改变了脂肪组织的分布；然而，尚未有通过过表达fto进行的治疗分析。

4、腺相关病毒（adeno-associatedvirus，aav）是目前发现结构最简单的、无包膜的单链dna病毒，病毒基因组长约有4.7kb，属于细小病毒家族。aav自身不能复制，必须依赖于其他病毒复制，比如腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒，有超过80%的人携带aav，未发现aav与任何疾病相关。aav通过cap蛋白与细胞表面的受体结合后通过细胞内吞作用进入细胞，aav进入细胞后会被转进细胞核中，这个过程中衣壳蛋白会逐步降解并释放出单链dna基因组。aav病毒作为治疗手段具有一些优点：低免疫原性（lowimmunogenicity，aav在人类和其他灵长类动物中非常普遍）；安全（strongsafetyrecord，aav对人类没有致病性） ；结构简单（simplestructure，aav是一层衣壳蛋白包裹着一条4.7kb长的单链dna的二十面体颗粒） ；个头小（smallsize，发现至今，最小的非包膜病毒） ；相对稳定（highstability，与慢病毒相比，aav看起来更像一个巨大的蛋白分子，mw=~5,200,000，能耐受一定范围的ph、温度、盐浓度等环境变化）；宿主广：即可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是为解决以上uc所致骨质疏松治疗的相关问题，提出一种能够体外诱导成骨细胞分化的fto突变体，其能够成为一种针对肠炎性骨质疏松治疗的新手段，在体外诱导成骨细胞分化。

2、本发明采用以下技术方案：

3、一种能够体外诱导成骨细胞分化的fto突变体fto-3kr，将野生型fto的第216位、第357位、第365位由赖氨酸（lysine，k）突变为精氨酸（arginine，r）后得到所述fto突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的第二个目的是提供一种腺相关病毒aav-fto-3kr，采用以下方法制备得到：

5、将上述fto突变体fto-3kr克隆到质粒载体中，使用pacⅰ限制性内切酶处理含有突变fto基因的目标质粒，然后转染到293t细胞中；收集转染完成的293t细胞，进行重悬和冻融；采用aav病毒上清液感染293t细胞；

6、重复以上步骤，富集含病毒颗粒的病毒上清液，然后离心并透析得到纯化后的腺相关病毒aav-fto-3kr。

7、所述腺相关病毒aav-fto-3kr在无细胞毒性浓度下即可促进成骨细胞的分化和矿化。而在骨髓腔进行aav-fto-3kr治疗后，骨质疏松小鼠的骨体积分数和骨小梁数目部分恢复，松质骨骨量得到保护，bmsc的成骨、成脂的命运转化发生了逆转。

8、本发明的第三个目的是提供上述腺相关病毒aav-fto-3kr在制备预防或治疗骨质疏松药物中的应用。

9、进一步地，所述骨质疏松为肠炎性骨质疏松。

10、进一步地，腺相关病毒aav-fto-3kr促进成骨细胞分化和骨形成。

11、进一步地，腺相关病毒aav-fto-3kr促进骨髓间充质细胞向成骨分化，抑制骨髓间充质细胞向成脂分化。

12、本发明的第四个目的是提供一种预防或治疗肠炎性骨质疏松的药物，其有效成分包括腺相关病毒aav-fto-3kr。

13、进一步地，还包括辅料或药学上可接受的载体。

14、进一步地，所述的预防或治疗肠炎性骨质疏松的药物的剂型包括注射制剂、外用制剂、口服制剂、缓释制剂或控释制剂，优选为注射制剂，采用纯化后的aav-fto-3kr，添加通用的辅助成分，制成aav-fto-3kr溶液制剂后进行注射。具体地，用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

15、本发明药物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

16、进一步地，所述的治疗骨质疏松疾病药物的剂量为100μl/kg/d。根据当前aav-fto-3kr治疗肠炎性骨质疏松小鼠的动物试验结果，本发明在后续治疗肠炎性骨质疏松疾病时，aav-fto-3kr的给药剂量可以根据不同的给药方式、病人的年龄、病人的体重和病人的骨质疏松程度等其他相关因素而改变。

17、本发明的有益效果是：

18、本发明制备了一种fto蛋白的突变体，不会改变fto蛋白的稳定功能、核定位功能，但是影响了其去m6a修饰酶的功能，使其具有促进成骨细胞分化和矿化的独特作用。将其转染获得腺相关病毒aav-fto-3kr后应用干预肠炎性骨质疏松的治疗，发现其在体内具有意想不到的促进成骨细胞骨形成和抑制成脂细胞分化的作用，显著促进了uc小鼠模型中bmsc的成骨形成，抑制了bmsc的成脂形成，显著改变了bmsc的分化命运，发挥了抗骨质疏松作用。

19、本发明对肠炎性相关骨质疏松疾病的研究和治疗产生重大影响，并有一定潜在的临床实用价值，为fto蛋白开辟了新的临床用途。本发明开发fto相关的突变体，及腺相关病毒，属于临床前用药，拓展了fto蛋白突变体的疾病应用领域，使用剂量较常规剂量少，副作用小。而动物试验结果提示，aav-fto-3kr能够显著防治因肠炎疾病导致的骨量丢失。aav-fto-3kr或其药学上可接受的载体制备的制剂具有治疗其他类型骨质疏松药物的应用前景。